結(jié)腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已成為全球癌癥死亡的第二 大主因。西方發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率都呈上升趨勢(shì) [1-2]，因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)并對(duì)癥治療，延長(zhǎng)病人生存期并有效控制結(jié)腸癌的發(fā)展具 有重要意義。臨床上主要的治療手段有手術(shù)、放/化療及生物療法。對(duì)于化療 藥物而言，5-氟尿°密咬（5-fluorouradl, 5-FU)仍為目前最主要和最廣泛應(yīng)用 的藥物。由于普通口服制劑的吸收不規(guī)則，對(duì)胃腸刺激嚴(yán)重，5-FU的臨床給 藥形式以靜脈注射為主[u]。靜脈注射會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的全身毒副作用，且病人的 順應(yīng)性差，影響治療效果。因此將5-FU制成經(jīng)口給藥后避免在胃、十二指腸、 空腸和回腸前端釋藥，完整運(yùn)送到回盲部后釋放至結(jié)腸的給藥體系，即口服 結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)（oral colon-specific drug delivery system, OCDDS ) [4-5]用于 結(jié)腸癌的化療具有現(xiàn)實(shí)的臨床實(shí)用價(jià)值。該系統(tǒng)可以直接將藥物釋放至結(jié)腸， 避免了藥物在上消化道不必要的釋放和吸收，達(dá)到提高結(jié)腸病灶部位藥物濃 度，降低藥物用量，減少全身吸收，減低藥物潛在毒、副作用的目的，最終 提高了臨床治療效果。

吲咮美辛（Indomethacin, IDM)系非甾體類抗炎藥（NSAIDs),臨床上 用于風(fēng)濕性疾病及多種關(guān)節(jié)炎的治療。近年來(lái)大量的流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)研 究已證明IDM等NSAIDs可通過(guò)抑制環(huán)氧化酶-2 (C0X-2)等多種途徑抑制 細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在一定程度上起到預(yù)防和治療結(jié)腸癌的作用【6—9]。 然而NSAIDs對(duì)胃腸道的刺激和毒性反庭嚴(yán)重，限制了它們?cè)诮Y(jié)腸癌化學(xué)預(yù) 防中的長(zhǎng)期應(yīng)用。因此將NSAIDs制成OCDDS，乾向于結(jié)腸局部釋藥，可以 避免藥物對(duì)上消化道的刺激，提高病灶部位的藥物濃度，降低藥物的全身毒 性，最終改善藥物對(duì)結(jié)腸癌的防治效果。

目前制備OCDDS的方法有多種，但不外乎采用藥劑學(xué) (formulation-specifc)和化學(xué)（drug-specific)兩種方法。根據(jù)釋藥機(jī)制可將 OCDDS分為以下三種主要類型：pH敏感型釋藥系統(tǒng)、時(shí)間依賴型釋藥系統(tǒng) 和酶促發(fā)型釋藥系統(tǒng)[1(M4]。

pH敏感型OCDDS:這類釋藥系統(tǒng)類似于經(jīng)典的腸溶包衣制劑。即利用 整個(gè)胃腸道中小腸末端的pH值最高的特點(diǎn)[15-16],應(yīng)用在特殊pH條件下溶解 或溶脹、容蝕的聚合物作為包衣材料，將藥物制劑包衣，避免藥物在上消化 道釋放，達(dá)到將藥物運(yùn)送到小腸末端開始釋放的目的。由于腸溶包衣材料性 能成熟、方便易得以及制備工藝簡(jiǎn)單，pH敏感型成為OCDDS中最簡(jiǎn)便易得 的一種類型。目前已上市的口服結(jié)腸制劑大多為這種類型，如治療潰瘍性腸 炎的Asacol®和Salofalc® ( 5-氨基水楊酸)；治療克羅恩氏病的Budenofalk® 和Entocort® (布地奈德）。然而令人遺憾的是，由于小腸后端即回腸處的pH 值即在7-8,近端結(jié)腸由于大量的食物殘法被消化為短鏈脂肪酸，pH值回 落到6.5左右[11’15]，而通常使用的丙烯酸樹脂的溶解值為pH 6 (Eudrgit®L) 和pH7(Eudrgit®S/Eudrgit®FS30D),這將導(dǎo)致藥物的提前釋放。另外個(gè)體 間/個(gè)體內(nèi)pH值的差異性以及病理狀態(tài)下pH值的變化也使得單純采用pH敏 感包衣實(shí)現(xiàn)藥物的結(jié)腸遞送變得不可靠。

時(shí)間依賴型OCDDS:根據(jù)口服制劑到達(dá)結(jié)腸所需要的時(shí)間，用適當(dāng)?shù)姆?法延遲制劑的釋藥時(shí)間，即口服后約經(jīng)5-6h開始釋藥，可達(dá)到定位于結(jié)腸釋 藥的目的，與pH敏感型不同，時(shí)間依賴型OCDDS不能通過(guò)單層包衣達(dá)到目 的，一般需采用情性/腸溶包衣與形成凝膠膨脹層或滲透泵等兩種或多種原理 相結(jié)合的工藝方法才能實(shí)現(xiàn)延遲5-6h釋藥的目的[17_19]，制備工藝相對(duì)復(fù)雜， 影響釋藥部位的因素較多。

酶促發(fā)型OCDDS (生物降解型OCDDS):盲、結(jié)腸內(nèi)存在多種胃和小 腸中不存在、由微菌群產(chǎn)生的酶，如偶氮降解酶、糖苷酶、葡萄苷酸酶、果 肢酶、葡聚糖酶等等[5’2()]，它們能專一地降解相應(yīng)的物質(zhì)，可作為理想的結(jié)腸 靶向釋藥機(jī)制。利用可被酶降解的物質(zhì)，將藥物制成前體藥物或骨架/包衣制 劑，到達(dá)結(jié)腸后經(jīng)酶解作用而釋藥的OCDDS稱為酶促發(fā)型OCDDS。與胃腸 道的pH值及轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間不同，結(jié)腸內(nèi)存在的大量菌群具有位點(diǎn)特異性，是一 獨(dú)立的釋藥促發(fā)機(jī)制，因此酶促發(fā)釋藥目前被認(rèn)為是OCDDS中最可靠的一 種釋藥機(jī)制〇22]。常用的可生物降解材料中除偶氮聚合物外均為天然多糖類 物質(zhì)，如脫乙酰殼聚糖、果肢、瓜爾膠、葡聚糖、菊粉、硫酸軟骨素、環(huán)糊 精等[2347]。這類材料除了具有生物可降解性、生物相容性、溶脹性和可成膜 性的特點(diǎn)之外，它們來(lái)源豐富、價(jià)廉、安全無(wú)毒，被公認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)結(jié)腸靶向 最具實(shí)用價(jià)值的材料。然而多糖類物質(zhì)的高親水性，對(duì)藥物的保護(hù)能力有限， 易造成藥物的提前釋放，并且多糖類物質(zhì)遇水形成高粘度的溶液，限制了劑 型制備的種類，到目前為止國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究停留在骨架片和壓制包芯片的 制備123^29]。骨架片通過(guò)擴(kuò)散/溶蝕機(jī)制釋藥，因此在胃和小腸內(nèi)即有大量 的藥物釋出，無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效的釋藥時(shí)滯。壓制包芯片在包衣過(guò)程中使用較大 壓力，形成非常緊密的包衣層，雖然可保護(hù)藥物安全通過(guò)胃和小腸，但是進(jìn) 入結(jié)腸后多糖衣層的水化速度慢，酶不易進(jìn)入衣層發(fā)揮降解作用，最終導(dǎo)致 酶促發(fā)藥物釋放機(jī)制的靈敏度下降，藥物在結(jié)腸內(nèi)釋放緩慢，且藥物可能釋 放不冗全。

因此，要實(shí)現(xiàn)有效的結(jié)腸定位釋藥通常不能依靠一種釋藥機(jī)制，往往需 幾種機(jī)制共同作用，才能克服消化道的生理屏障，實(shí)現(xiàn)藥物的結(jié)腸遞送與釋

放。

瓜爾股（guar gum, GG )是從廣泛種植于印巴次大陸的豆科植物瓜

爾豆中提取得到的一種植物膠。其主要成分為半乳甘露聚糖，就其分子結(jié)構(gòu) 來(lái)說(shuō)是一種非離子多糖，主鏈由(l-4)-yS-D-甘露糖為單元連接而成，側(cè)鏈由 單個(gè)a-D-半乳糖組成并以(1-6)鍵與主鏈相接，甘露糖/半乳糖的比例為2:1 [2?21](結(jié)構(gòu)見圖1)。瓜爾肢遇水溶脹并形成粘性的膠體溶液，除了廣泛用 做食品增稠劑外，可以作為粘合劑和阻滯劑用于制劑的研制。由于瓜爾膠的 膠凝作用可以阻滯藥物自制劑中的釋放，同時(shí)它可被盲/結(jié)腸中的細(xì)菌產(chǎn)生的 酶降解[3M1]，因此成為近年來(lái)OCDDS中研究較多的可生物降解材料之一 [29,32-34】。由于瓜爾膠遇水形成高粘度的股體溶液，使其在酶促型OCDDS中 的應(yīng)用目前僅限于骨架片和壓制包芯片的研究[23’29,33’35_38]。而小丸具有胃腸道 分散均勻，與腸粘膜接觸面積大、轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間受胃腸道生理狀態(tài)影響小等優(yōu)點(diǎn)， 被認(rèn)為是目前口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)的最佳劑型[3941]。

因此本文以小丸為劑型，瓜爾膠為可生物降解的材料，5-氟尿嘧啶和吲 咮美辛為模型藥，立足于最具結(jié)腸靶向特異性的酶促發(fā)釋藥機(jī)制，結(jié)合pH 敏感/時(shí)間依賴釋藥機(jī)制，通過(guò)流化床包衣技術(shù)分別研制了 pH敏感-酶促皮雙 重控制OCDDS和時(shí)間依賴-酶促發(fā)雙重控制OCDDS,考察它們的體內(nèi)、外 釋藥行為，評(píng)價(jià)其結(jié)腸靶向性，以獲得制備結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)的可靠技術(shù)， 為臨床治療/預(yù)防結(jié)腸癌提供療效確切、毒副作用低的5-氟尿嘧咬和吲咮美辛 的新劑型。并且，5-氟尿'癌咬和吲咮美辛作為水溶性藥物和難溶性藥物的代 表為其他藥物的口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)的研究提供了指導(dǎo)和借鑒。

受胃腸道生理特點(diǎn)及材料固有特性的制約，依靠單一機(jī)制釋藥的OCDDS 往往在體內(nèi)的結(jié)腸靶向有效性和重復(fù)性不佳[“5]。本章采用pH-酶雙重促發(fā)機(jī) 制設(shè)計(jì)口服結(jié)腸定位釋藥小丸，原理如圖1.1所示。分別以Eudragit FS30D 和瓜爾肢為外層pH敏感衣及內(nèi)層酶敏感衣對(duì)載藥丸芯進(jìn)行雙重包衣。外衣 膜Eudragit FS30D保護(hù)藥物通過(guò)胃、十二指腸和空腸，到達(dá)回腸后在pH值 為7?8的腸液中溶解（EudragitFS30D的溶解閾值為pl^7),內(nèi)層瓜爾膠暴 露于腸液中。瓜爾膠在水溶性的環(huán)境中不斷地吸水、溶脹，逐步在小丸表面 形成稠厚的凝膠層，這層凝膠層既減緩水分繼續(xù)向內(nèi)滲入同時(shí)也阻礙藥物向 外滲出，因此可以在Eudragit FS30D溶解后繼續(xù)保護(hù)藥物不釋放。當(dāng)包被瓜 爾膠凝股層的小丸進(jìn)入結(jié)腸后，結(jié)腸內(nèi)微菌群產(chǎn)生的酶擴(kuò)散進(jìn)入凝膠層發(fā)揮 酶解作用，瓜爾肢被水解為短鏈寡糖，凝肢層逐漸松散并消失，位于丸芯的 藥物層可以以更快的速度釋出。

Pellet remains €nteric coatGuar gumDrug diffusion• Guar gum is degraded and drug

intact 1 dissolvesswellsbegins1 releases

1

proximaldistal (pH7.0?7.5)ilecH^ecal junction

stomach small intestinej colon

Fig. 1.1 Schematics of the conceptual design of the pH-and enzyme-controlled colon-specific delivery

system (not to scale).

 

1.材料與儀器

1.材料

5_氟尿嘧啶(批號(hào)〇2〇%1)

聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30)

聚乙二醇（PEG4000)

羥丙曱纖維素（HPMC, 5cPa-s)

蔗糖丸芯（PF101, 710-850(im) 瓜爾膠

(規(guī)格分別為 900 ~ 1300cps、2600 5500cps)

腸溶型丙烯酸樹脂水分散體 (Eudragit FS30D)

檸檬酸三乙酯（TEC)

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg)

5-溴尿嘧啶（5-BU,內(nèi)標(biāo)）

甲醇（色譜純）

用于HPLC的試劑為色譜純，鹽酸、

分析純

2.儀器

JGM-H50氣流粉碎機(jī)

UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)

BS210S電子天平

BS610S電子天平

85-2型恒溫磁力攪拌器

微型流化包衣設(shè)備

GPCG1.1型流化包衣機(jī)

藍(lán)森牌離心式單相交流鼓風(fēng)機(jī)

DDB-320多功能電子蠕動(dòng)泵

ZRS-8G智能溶出儀

S-520掃描電子顯微鏡

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀

南通制藥總廠

國(guó)際特品（香港）有限公司 上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站 上海Colorcon包衣技術(shù)有限公司 法國(guó)NP Pharm公司 法國(guó)Rhodia公司

~ 3100cps、4000 ~ 4500cps 和 5200 ?

德國(guó)degussa R6hm公司

美國(guó)Morflexs公司 Fluka Biochemika Sigma公司 Merck公司

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等其他試劑均為

華東理工大學(xué) 曰本島津 Sartorius Sartorius

上海智威電器有限公司 自制

德國(guó)Glatt公司 浙江溫嶺市潘郎鼓成機(jī)廠 寧波石浦海天電子儀器廠 天津大學(xué)無(wú)線電廠 曰本Hitachi公司 美國(guó)安杰倫公司 

(G1322ADEGASSER, G1311A QuatPump, G1313A ALS, G1315B DAD )

XW-80型旋渦混合器上海超聲波儀器廠

3.動(dòng)物

Wistar大鼠，250±20g，清潔級(jí)復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部 Beagle犬，3，8.0±2.0 kg,普通級(jí)上海市新岡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)

2.實(shí)驗(yàn)方法

1.體外分析方法的建立

1.15-FU小丸含量測(cè)定方法的確定

1.1,1小丸含藥量測(cè)定波長(zhǎng)的確定

參照中國(guó)藥典，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制一定濃度()的5-FU 溶液，于200 ~400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取5-FU100 mg，用pH7.4PBS溶解定容于100 ml量瓶。分別精密 吸取一定體積的溶液，作不同倍數(shù)的稀釋，所得濃度分別為3、6、9、12、 15、18pg/ml，于所確定的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度（A)對(duì)來(lái)度（C, pg/ml) 作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程'。

1.1.3輔料干擾試驗(yàn)

稱取處方量輔料于1〇〇1111量瓶中，加入0117.4?88適量，超聲1〇111丨11后 定容。離心(3500rpm, 15min)、過(guò)濾，續(xù)濾液經(jīng)50倍稀釋后于200~400nm

波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

1.1.4回收率試驗(yàn)

精密稱取40、50、60 mg 5-FU置于100ml量瓶中，再稱取相當(dāng)于一個(gè)劑 量的輔料加入到上述量瓶中，加PH7.4PBS適量，超聲后定容。離心(3500rpm， 15min)、過(guò)濾，續(xù)濾液50倍稀釋后于265nm處測(cè)定吸收值。以測(cè)得的量和 加入的量比較，計(jì)算回收率。

1.1.5 5-氟尿嘧啶吸收度穩(wěn)定性試驗(yàn)（室溫）

精密稱取5-FU100 mg,用pH7.4PBS溶解并轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中并定容 至刻度。分別吸取一定體積的溶液，作不同倍數(shù)的稀釋，所得濃度分別為3、 9、15pg/ml,室溫放置，分別于第Oh、6h、12h和24h在波長(zhǎng)265nm處測(cè) 定吸收度。

1.1.6小丸含藥量的測(cè)定

精密稱取相當(dāng)于含5-FU 50mg的小丸，在研缽中加適量的pH7.4PBS充 分研磨至完全溶解，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加pH7.4PBS適量，超聲10 min 后定容。離心(3500rpm, 15min)、過(guò)濾，續(xù)濾液用pH7.4PBS 50倍稀釋，于 265nm處測(cè)定吸收度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物的濃度。

1.25-FU小丸體外釋放度測(cè)定方法的確定

本文分別以 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作為模擬

胃、小腸中前段（十二直腸和空腸）、小腸后段（回腸）及結(jié)腸pH環(huán)境的釋 放介質(zhì)；含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS作為模擬在體結(jié) 腸酶環(huán)境的釋放介質(zhì)。因此考察37°C下5-FU在不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性及酶和 其它輔料對(duì)測(cè)定的影響，分別建立4種釋放介質(zhì)中5-FU測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線并考 察其回收率。

1.2.1四種釋放介質(zhì)中檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別用 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 配制一定濃度（l〇ng/ml) 的5-FU溶液，于200 ~ 400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

1.2.2釋藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取5-FU100mg，用上述介質(zhì)溶解、轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中并定容至 刻度。精密吸取一定體積的溶液，稀釋至3、6、9、12、15、18ng/ml，于所 確定的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度（A)對(duì)濃度（C, pg/ml)作線性回歸， 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.35-FU在四種釋放介質(zhì)中的穩(wěn)定性考察（37°C )

方法同釋藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，在37°C水浴中分別于第0h、6h、12h、 20 h和24 h在波長(zhǎng)265nm處測(cè)定吸收度。

1.2.4釋放介質(zhì)中的輔料干擾試驗(yàn)

稱取處方量空白包衣小丸，裝于轉(zhuǎn)籃中，分別置于900ml恒溫37±0.5°C 的4種釋放介質(zhì)中，轉(zhuǎn)速為75rpm, 20 h后取樣，樣品經(jīng)0.8 jim微孔濾膜過(guò) 濾后，在200?400nm范圍對(duì)釋放液進(jìn)行紫外掃描。

1.2.5釋藥回收率試驗(yàn)

精密稱取5-FU 50 mg置于100ml量瓶中，再稱取相當(dāng)于一個(gè)劑量的輔料 加入到上述量瓶中，分別加入0.1MHC1、pH6.8、pH7.4和pH6.5PBS，超聲 lOmin后定容。分別稀釋至3、9、15ng/ml，于265nm處測(cè)定吸收值。以測(cè) 得的量和加入的量比較，計(jì)算回收率。

1.2.6半乳甘露糖苷酶（galactomannanase)對(duì)釋放度測(cè)定的干擾試驗(yàn)

半乳甘露糖苷酶為瓜爾膠的水解酶，稱取適量，用pH6.5 PBS配置成 0.0388 U/ml的酶溶液，在200 ~ 400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

1.3腸內(nèi)容物法模擬在體結(jié)腸環(huán)境體外釋放度試驗(yàn)中5-FU測(cè)定方法一HPLC 法的確定

1.3.1色譜條件

色譜柱：DiamonsilTM-C18(4.6mmx250mm，5(im)

流動(dòng)相：曱醇:7K=5:95 流速： 1.0 ml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm 柱溫：30°C 進(jìn)樣量：20卩1

1.3.2樣品處理方法

樣品離心后（lOOOOrpm, lOmin)，上清經(jīng)0.45(im的微孔濾膜過(guò)濾，續(xù) 濾液用純水稀釋10倍后，20W進(jìn)樣分析。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取5-FU100 mg,用含4%大鼠盲腸內(nèi)容物(新鮮制備)的pH6.8PBS (10000 rpm, 10 min離心后）溶解、轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中并定容至刻度，作 為儲(chǔ)備液。精密吸取一定體積的儲(chǔ)備液，不同倍數(shù)稀釋后，來(lái)度（C)分別 為 0.5、1、10、50、100、200、300pg/ml。按樣品處理方法操作，HPLC 法 測(cè)定，以藥物峰面積（A)對(duì)濃度（C，pg/ml)作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方 程。

1.3.4回收率與精密度測(cè)定

精密吸取一定體積的儲(chǔ)備液，稀釋不同的倍數(shù)到濃度（C )分別為1、50、 200)tig/ml，按樣品處理方法操作，以測(cè)得濃度對(duì)實(shí)際濃度之比計(jì)算回收率。

精密吸取一定體積的儲(chǔ)備液，稀釋不同的倍數(shù)到濃度（C)分別為1、50、

200pg/ml,按樣品處理方法操作，并作色譜分析。一天內(nèi)重復(fù)五次，統(tǒng)計(jì)測(cè) 定數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，即為方法的天內(nèi)精密度。連續(xù)五天重復(fù)操作， 統(tǒng)計(jì)測(cè)得數(shù)據(jù)的RSD，即為方法的天間精密度。

1.3.5檢測(cè)限

用已知濃度的樣品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，按信噪比 S/N=3時(shí)相應(yīng)濃度確定檢測(cè)限。

2.載藥小丸的制備 2.1藥物的微粉化

采用水混懸液噴霧上藥，為防止混懸液中的固體顆粒堵塞噴嘴，一般要 求固體顆粒的粒徑<10^m,本研究用氣流粉碎機(jī)對(duì)藥物進(jìn)行微粉化，顯微鏡 下觀察藥物的粒徑范圍為2~ 10啤。

2.2用流化床制備載藥丸芯

用微型流化床預(yù)試空白丸芯混懸上藥的處方和工藝后，用GPCG1.1型 Glatt流化床制備載藥丸芯。將粘合劑PVP溶于水中（6%, W/V)，攪拌下將 微粉化的藥物分散于其中制成混懸液，即可用于噴液上藥。上藥過(guò)程中需要 連續(xù)攬拌藥物混懸液。載藥丸芯的制備工藝如下：

微型流化床：空白丸芯10g,噴嘴直徑0.5_，控制出口溫度25-28°C, 噴液速率l.Oml/min,在固定的風(fēng)量和霧化壓力下進(jìn)行噴液上藥。

Glatt流化床：空白丸芯lOOOg，底噴法，噴嘴直徑1mm，進(jìn)風(fēng)溫度50°C, 物料溫度35°C,流化風(fēng)量97-103m3/h,噴霧壓力1.5bar,噴液速率ll-13g/min。 上藥結(jié)束后，繼續(xù)流化干燥5min,接著包一層HPMC隔離衣，增重約為2% (W/W),以防止小丸在貯存過(guò)程中粘結(jié)，最終制得小丸約1495g。用篩析法 通過(guò)稱重測(cè)定小丸的粒徑分布，篩取18-24目的小丸用于包衣。

3.EudragitFS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的制備、釋藥影響因素及體外評(píng)價(jià)

3.1瓜爾膠包衣小丸的制備及影響其釋藥的因素 3.1.1包衣液的配制

稱取一定量的瓜爾膠，用適量的乙醇分散，攪拌下加入適量蒸餾水，最 終的包衣液為4%的瓜爾膠（W/V)在醇/水（1/4, V/V)體系中的混懸液。

3.1.2小丸包衣

將制備好的載藥小丸10 g加到自制微型流化床中，噴嘴直徑為0.8 mm, 控制出口溫度為28±2°C，噴液速率為1.2ml/min,在固定的風(fēng)量和霧化壓力 下進(jìn)行噴液包衣，直至達(dá)到預(yù)設(shè)的包衣增重（coat weight gain, CWG )。包衣 增重（％)=(包衣后丸重-包衣前丸重）/包衣前丸重xi〇〇%。包衣過(guò)程中需 要連續(xù)攪拌包衣液。小丸包衣完成后，將小丸置于60°C的烘箱中干燥6h。

3.1.3釋放度試驗(yàn)

按中國(guó)藥典2005版規(guī)定的第一法（轉(zhuǎn)籃法）測(cè)定。稱取適量包衣小丸（含 5-FU50mg)，裝于轉(zhuǎn)籃中，置于900ml恒溫37±0.5°C的釋放介質(zhì)中，轉(zhuǎn)速為 75rpm,定時(shí)取樣5ml,同時(shí)補(bǔ)充等量同溫的新鮮介質(zhì)。樣品經(jīng)0.8 pm微孔 濾膜過(guò)濾后，續(xù)濾液經(jīng)適當(dāng)稀釋后于265nm處測(cè)定吸收值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì) 算藥物的累計(jì)釋放百分率。

分別以 0.1mol/L HC1、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作為模擬胃、

小腸中前段（十二直腸和空腸)、小腸后段（回腸）及結(jié)腸pH環(huán)境的釋放介 質(zhì)[16-2(>]。為了評(píng)價(jià)結(jié)腸內(nèi)微菌群對(duì)瓜爾膠的酶解作用，在pH6.5PBS中加入 半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)來(lái)模擬在體結(jié)腸環(huán)境[6-1G]。

3.1.4酶法與腸內(nèi)容物法對(duì)瓜爾肢水解作用的比較

結(jié)腸內(nèi)大量的菌群可以產(chǎn)生多種天然多糖的水解酶，其中包括半乳甘露 糖苷酶，它可以降解瓜爾膠成短鏈寡糖。通常使用兩種體系即純酶系統(tǒng)和腸 內(nèi)容物系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)瓜爾膠對(duì)結(jié)腸內(nèi)的微菌群的酶解敏感性。本研究分別采用 兩種體系模擬在體結(jié)腸環(huán)境，進(jìn)行瓜爾肢包衣小丸的釋放度研究，并比較兩 種系統(tǒng)的優(yōu)、缺點(diǎn)。

3.1.4.1酶法[11_13]

加入不同量的半乳甘露聚糖酶至pH6.5PBS中，作為釋放介質(zhì)，進(jìn)行瓜 爾肢包衣小丸的釋放度試驗(yàn)。釋放介質(zhì)中酶的濃度分別為0.0024U/ml、 0.0097U/ml 和 0.0388U/ml。

3.1.4.2腸內(nèi)容物法[6’14_16]

連續(xù)7天，每天以lml的2% (W/V )瓜爾膠水溶液對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，誘 導(dǎo)大鼠盲腸內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)生瓜爾肢水解酶。在釋放度試驗(yàn)開始前30min，處死 大鼠，切開腹部分離盲腸，取出盲腸內(nèi)容物后稱重并迅速轉(zhuǎn)移到一直通有氮 氣的PH6.8PBS中，最終形成腸內(nèi)容物濃度為4% (W/V)的磷酸鹽緩沖溶液, 作為模擬結(jié)腸酶環(huán)境的釋放介質(zhì)進(jìn)行釋放度試驗(yàn)。由于結(jié)腸內(nèi)的菌群為厭氧 菌，所以在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，釋放介質(zhì)均保持通氮狀態(tài)。分別于預(yù)設(shè)的時(shí)間 取樣lml,并補(bǔ)充同等體積通氮的新鮮介廣。樣品處理按本章中試驗(yàn)方法下 的1.3.2項(xiàng)操作，并用HPLC法進(jìn)行含量分析。

3.1.5影響釋藥的因素

瓜爾肢包衣層阻滯藥物釋放的原因在于瓜爾肢遇水形成稠厚的凝膠層， 凝膠層的粘稠度及厚度與瓜爾肢粘度、包衣增重密切相關(guān)。

3.1.5.1瓜爾膠粘度的影響

分別選用粘度為 900~ 1300cps、2600~3100cps、4000~4500cps、5200 ? 5500cps的瓜爾肢對(duì)栽藥丸芯進(jìn)行包衣，考察同一包衣增重下瓜爾膠的粘度對(duì) 小丸釋放度的影響。

3.1.5.2瓜爾肢包衣增重的影響

考察同一粘度的瓜爾膠不同包衣增重小丸的釋放度。

3.1.5.3釋藥介質(zhì)pH的影響

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 四種釋放介質(zhì)對(duì)

GG包衣小丸釋放度的影響。

3.1.5_4瓜爾膠水解酶的影響

考察瓜爾膠包衣小丸在含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS

中的釋藥^亍為。

3.2Eudragit FS30D包衣小丸的制備及影響其釋藥的因素

制備EudragitFS30D包衣小丸，考察影響小丸釋藥的因素，確定最佳包 衣處方及工藝。在此后EudragitFS30D/瓜爾股雙重包衣小丸體內(nèi)、外釋藥行 為的評(píng)價(jià)中，均以Eudragit FS30D包衣小丸為參照制劑。 3.2.1包衣液的配制

稱取一定量的Eudragit FS30D (固含物濃度為30% )，加水稀釋至固含物 的濃度為10%，作為pH敏感型包衣液。

3.2.2小丸包衣

將制備好的載藥小丸10g加到自制微型流化床中，噴嘴直後0.5mm，控 制出口溫度24±2°C，噴液速率0.8ml/min，在固定的風(fēng)量和霧化壓力下進(jìn)行 噴液包衣，直至達(dá)到預(yù)設(shè)的包衣增重。包衣結(jié)束包后，小丸在流化床內(nèi)繼續(xù) 流化5min。

3.2.3包衣小丸的熱處理

小丸包衣完成后，將小丸置于恒溫40°C的烘箱中進(jìn)行2 h的熱處理，熱 處理過(guò)程中間隔一段時(shí)間需翻動(dòng)小丸，以使受熱均勻，防止粘連。

3.2.4釋放度試驗(yàn)

轉(zhuǎn)籃法測(cè)定，余下操作同3.1.3項(xiàng)下所述。分別以O(shè).lmol/L HC1 (2h)、 pH6.8PBS(2h)、pH7.4PBS(lh)作為模擬胃、小腸中前段（十二直腸和空腸） 及小腸后段（回腸）pH環(huán)境的釋放介盾。每次變換介廣在5min之內(nèi)完成。

3.2.5影響釋藥的因素

3.2.5.1增塑劑的影響

Eudragit FS30D推薦使用的增塑劑為杵橡酸三乙酯（TEC )，用量為2-5% 或可不使用[17],因此考察不使用TEC和用量為5%時(shí)小丸的釋藥行為。

3.2.5.2包衣增重的影響

考察包衣增重分別為20%、30%和40%時(shí)小丸的釋藥行為。

3.2.5.3熱處理時(shí)間的影響

40°C分別對(duì)包衣小丸進(jìn)行0、2、6、12h的熱處理后進(jìn)行藥物釋放度的測(cè) 定，考察熱處理時(shí)間對(duì)小丸釋藥行為的影響。

3.3Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的制備及體外釋藥評(píng)價(jià) 3.3.1小丸的包衣

依次按本章實(shí)驗(yàn)方法中3.1.2和3.2.2項(xiàng)下的操作對(duì)載藥丸芯進(jìn)行瓜爾膠 內(nèi)層包衣及FS30D外層包衣，包衣增重分別為580%和30%。

3.3.2釋放度試驗(yàn)

轉(zhuǎn)籃法測(cè)定。余下操作同3.1.3項(xiàng)下所述。分別以pH連續(xù)變化的介質(zhì)即 0.1mol/LHCl(2h)、pH6.8PBS(2h)、pH7.4PBS(lh)和 pH6.5PBS(12h)作為釋放 介質(zhì)，模擬胃、小腸中前段（十二直腸和空腸）、小腸后段（回腸）及結(jié)腸的 pH環(huán)境;pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.0097U/ml)來(lái)模擬在體結(jié)腸的

酶解環(huán)境。

4.小丸釋放度評(píng)價(jià)方法

比較兩條釋放曲線差異性的方法有多種，如方差分析法（ANOVA-based approaches)，非模型法（model-independent approaches)及模型依賴法 (model-dependent approaches )。其中非模型法的f2相似因子法能靈敏、準(zhǔn)確 地反映溶出或釋放曲線之間的差異[18—19]。計(jì)算的公式如下：

>n]~°.5]

/2=501og< \ + \ln^YjVt{R,-T)2xl〇〇l

其中f2:相似因子

Rt: t時(shí)間對(duì)照制劑的累積釋藥百分率

Tt: t時(shí)間試驗(yàn)制劑的累積釋藥百分率

n:釋放度試驗(yàn)取樣點(diǎn)數(shù)

Wt:權(quán)重因子（所有數(shù)據(jù)點(diǎn)同等對(duì)待時(shí)Wt=1.0 )

該方程是方差總和的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換形式，f2值可以靈敏地反映出兩者體外釋 放度差異。f2值在50 ~ 100之間表明兩條曲線相似。f2越大，表明體外釋放 度越接近。當(dāng)f2=100時(shí)，兩者具有完全相同的釋放度；f2值<50,兩者釋放度 則存在明顯差異，隨f2減小而差異增大，當(dāng)f2趨近于0時(shí)，則釋放度差異最

大。

本文均采用込相似因子法評(píng)價(jià)釋放度的差異性。

5.掃描電鏡觀察

用掃描電鍵觀察FS30D/GG雙層包衣小丸的剖面結(jié)構(gòu)及GG包衣小丸釋 放前后的表面形態(tài)。觀察前樣品噴金，以使其具有導(dǎo)電性。

6.體內(nèi)分析方法的建立

5-FU是臨床上常用的抗腫瘤藥物，對(duì)消化道癌和其他實(shí)體瘤均有良好的 療效。測(cè)定5-FU血藥濃度的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)。本文參考 文獻(xiàn)報(bào)道的分析方法[2G_21]，采用下述的反相高效液相色譜法測(cè)定犬口服5-FU 制劑后的血藥濃度。

6.1色譜條件

色譜柱：DiamonsilTM-C18(4.6mm><250mm, 5|im)

流動(dòng)相：甲醇：7^=5: 95 流•速：1.0 ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm 柱溫：30°C

內(nèi)標(biāo)：5-BU (10|ag/ml)

進(jìn)樣量：20(^1

記錄5-FU與5-BU的峰面積比為響應(yīng)參數(shù)，內(nèi)標(biāo)法定量。

6.2血漿樣品處理方法

精密吸取犬血漿50〇nl，5-BU(10|ag/ml)10〇W于lSml離心管中加入5ml乙 酸乙酯，旋渦混合lOmin，離心15min(3500rpm)，取上層有機(jī)層于5ml潔凈離 心管中，于40°C水浴中用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)胠OOjil流動(dòng)相溶解，離心后取2〇nl

進(jìn)樣分析。

6.3血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取犬血漿5004,加入5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液（100^1),使?jié)舛确謩e為20, 50，100, 200, 400，600，800ng/ml，加入內(nèi)標(biāo)的方法同上，按血漿樣品處理 方法操作，以HPLC法測(cè)定，以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值R( A5.FU/A5.BU ) 對(duì)樣品濃度（C5_FU)作線性回歸，求回歸方程。

6.4血藥濃度分析方法的評(píng)價(jià)

6.4.1方法精密度

取空白血漿500|nl數(shù)份，加入5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為50、200、 600ng/ml,加入100^1內(nèi)標(biāo)溶液，按血漿處理方法操作并作色譜分析。一天 內(nèi)重復(fù)五次，統(tǒng)計(jì)測(cè)定數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，即為方法的天內(nèi)精密度。 連續(xù)五天重復(fù)操作，統(tǒng)計(jì)測(cè)得數(shù)據(jù)的RSD,即為方法的天間精密度。

6.4.2方法回收率

取空白血漿500W數(shù)份，加入5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為50、200、 600ng/ml，加入100^1內(nèi)標(biāo)溶液，每一濃度配置五份樣品，按血漿處理方法 操作并作色譜分析，以測(cè)得的濃度對(duì)實(shí)際濃度之比計(jì)算方法回收率， 6.4.3提取回收率

取空白血漿5004數(shù)份，加入5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為50、200、 600ng/ml,每一濃度配置五份樣品，按血漿處理方法操作并作色譜分析，分 別與同濃度的5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣的峰面積做比較，計(jì)算提取回收率。 6.4.4檢測(cè)限

用已知濃度的樣品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，按信噪 比S/N=3時(shí)相應(yīng)濃度確定檢測(cè)限。

6.4.5最低定量限

樣品中被測(cè)物能夠被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確 度和精密度（兄SD£20 % ,這20 %，測(cè)定偏差E = (C *i-CU)/C標(biāo)><1〇〇 % )。

7.Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸在犬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究

口服OCDDS后進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)研究，根據(jù)不同時(shí)間下的血藥濃度，可 計(jì)算出制劑的T^、C_和AUC,更為關(guān)鍵的是可以了解該制劑的體內(nèi)吸收 時(shí)滯，以此估計(jì)吸收是否在到達(dá)結(jié)腸后開始，即通過(guò)藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)可以評(píng) 價(jià)制劑的結(jié)腸把向性。

7.1研究對(duì)象

Beagle 犬 5 只，8.0±2.0kg,普通級(jí) 7.2試驗(yàn)制劑與參比制劑

受試制劑：FS30D/GG雙重包衣小丸：FS30D層包衣增重30%, GG層包衣 增重580%。

參比制劑：栽藥小丸

FS30D包衣小丸，包衣增重30%。

7.3試驗(yàn)設(shè)計(jì) 服藥方法：

采用自身對(duì)照交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，洗凈期為1周。5只犬，禁食過(guò)夜（18h), 次日清晨空腹給藥(含5-FU 50mg),用10ml水灌胃。由于本章Eudragit FS30D/ 瓜爾肢雙重包衣小丸和后文第三章中瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸的犬體內(nèi) 藥物動(dòng)力學(xué)研究均以5-FU栽藥小丸為參比制劑，因此兩部分藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 一起完成。服藥方案見表1.1。

血樣采集：

于服藥前后設(shè)定的時(shí)間從前肢靜脈取血1.2ml，置于肝素鈉離心管中， 8000rpm離心lOmin，取上清血漿于-20°C冷凍保存，待分析。

服用載藥小丸的取樣時(shí)間點(diǎn)：5min、15min、30min、45min、lh、1.5h、 2h、 3h、 4h、 5h、 7h、 9h。

服用FS30D包衣小丸的取樣時(shí)間點(diǎn)：lh. 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、

10h、 12h、 24h

服用FS30D/GG雙重包衣小丸的取樣時(shí)間點(diǎn)：lh、2h、3h、4h、5h、6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h

樣品分析方法：

用本文建立的HPLC法測(cè)定血漿中的5-FU濃度。

7.4數(shù)據(jù)處理

直接讀取(：_和Tmax，并用t檢驗(yàn)法對(duì)兩參數(shù)進(jìn)行方差分析（其中Cmax 經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）。

Tab 1.1 Design of administration method of subjects receiving four fonnulations.

SubjectPhase of administration

IiiHIIV

1ABcD

2BCDA

3CDAB

4DABC

5ACBD

A:uncoated pelletsB: FS30D coated pellets

C: FS30D/GG doubble coated pellets D: GG-EC mixed coated pellets 三.結(jié)果與討論 i.體外分析方法的評(píng)價(jià) 1.1 5-FU小丸含量測(cè)定分析方法的評(píng)價(jià) 1.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確立

紫外掃描圖譜（圖1.2)表明在pH7.4PBS中5-FU的最大吸收波長(zhǎng)為 265nm,因此選擇265nm作為小丸含量測(cè)定的波長(zhǎng)。

U.2含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

在pH7.4的PBS中，5-FU在3 ~ 18pg/ml的范圍內(nèi)，吸收度和濃度的線 性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.0482C-0.0027 (r-0.9999)

1.1.3輔料干擾試驗(yàn)

圖1.3表明輔料在波長(zhǎng)265nm處對(duì)主藥的測(cè)定無(wú)吸收干擾峰（A=0.005 )。

Fig. 1.2 The ultraviolet spectrum of excipient of pellets in pH7.4PBS. 1.1.4回收率試驗(yàn) 結(jié)果見表1.2

Tab 1,2 Accuracy of 5-fluorouracil in pH7.4PBS.

Cadded (Hg/ml)CdetectedAccuracy

(%)Mean ± SDRSD (%)

88.15±0.14101.88

1010.16 士 0,14101.60100.99± 1.301.28

1211.94±0.1299.50

 

選取小丸含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線上高、中、低三個(gè)濃度，分別于不同的時(shí)間 測(cè)定吸收度。結(jié)果見表1.3。表明5-FU在pH7.4PBS中24h內(nèi)穩(wěn)定。

Tabl .3 Absorbance of 5-fluorouracil in pH7.4PBS for 24h (n=3).

5-FUAbsorbanceMeanSD

(Hg/ml)Oh6h12 h24 h

30.1410.1440.1470.1460.1450.003

90.4320.4340.4460.4430.4390.007

150.7200.7250.7380.7370.7300.009

1.25-FU小丸體外釋放度測(cè)定方法的評(píng)價(jià) 1.2.1四種釋放介質(zhì)中檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

由圖 1.4 可知 5-FU 在 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 四種釋放

介質(zhì)中的紫外掃描圖譜無(wú)區(qū)別，最大吸收波長(zhǎng)均為265nm。

1.2.2釋藥標(biāo)準(zhǔn)曲線

四種釋放介質(zhì)中，5-FU吸收度和濃度的線性曲線方程分別為： 0.1MHC1A=0.0535C+0.0013 (r-0.9999) 濃度范圍：3 ~ 18pg/ml

濃度范圍：3 ~ 18|ug/ml 濃度范圍：3 ~ 18(ig/ml 濃度.范圍：3 ~ 18jxg/ml

pH6.8PBSA=0.0530C+〇.〇〇75 (t-0.9999)

pH6.5PBSA-0.0541C+0.0024 (r^l.OOOO)

pH7.4PBSA=0.0482C-0.0027 (r=0.9999)

37°C水浴下不同時(shí)間5-FU在四種釋放介質(zhì)■中的吸收值見表1.4。

Tabl.4 Absorbance of 5-fluorouracil in different media at different time (n=3).

0.1MHC1

5-FUAbsorbanceMean土 SD

(Hg/ml)Oh6h12 h

30.1630.1650.1600.163±0.001

90.4850.4830.4870.485 土 0.001

150.8000.8030.8060.803土 0.000

pH6.8PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(Hg/ml)Oh6h20 h

30.1700.1680.1670.168 士 0.002

90.4790.4780.4770.478土0.001

150.8060.8050.8020.804土 0.002

pH6.5PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(fig/ml)Oh6h12h24 h

30.1660.1680.1690.1680.168 土 0.001

90.4870.4880.4860.4870.488土 0.001

150.8160.8130.8140.8050.812士0.005

pH7.4PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(|ag/ml)Oh6h12h24 h

30.1410.1470.1470.1460.145 土 0.003

90.4320.4340.4360.4360.432土 0.002

150.7200.7220.7180.7230.721 士 0.002

表明5-FU在體外釋放度試驗(yàn)過(guò)程中穩(wěn)定性良好，分析方法有效可行。

1.2.4釋放介質(zhì)中的輔料千擾試驗(yàn)

由圖1.5可知輔料在四種釋放介質(zhì)中基本無(wú)千擾。

Figl .5 The ultraviolet spectra of excipient in different dissolution media(0.1M HC1, pH6.8,

pH7.4 和 pH6.5 PBS).

1.2.5釋藥回收率

四種釋放介質(zhì)中的釋藥回收率見表1.5，回收率均在98 ~ 103%之間，符

合要求。

Tab 1.5 Accuracy of 5-fluorouracil in different dissolution media.

0.1MHC1

Cadded (Hg/ml)Cdetected (f^§/ml)Recovery (%)Mean 土 SDRSD (%)

33.11 土 0.10103.67

99.20 土 0.07102.22102.92± 0.730.71

1515.29±1.16102.87

pH6.8PBS

Cadded (|ig/ml)CrfetectedAccuracy (%)Meari 士 SDRSD (%)

33.06 士 0.04101.92

98.84 士 0.0998.07100.06土 1.931.93

1515.05±0.09101.19

pH6.5PBS

Cadded (l^g/ml)C detectedAccuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

33.13±0.17104.33

99.16±0"09101.78102.57士 1.531.48

1515_24 土 0.09101.60

 

Cadded (^g/ml)CdetectedAccuracy (%)Mean 土 SDRSD(%)

33.06 士 0.10102.00

99.12±0.14101.33100.82± 1.501,49

1514.87 士 0.1499.13

1.2.6半乳甘露糖苷酶在pH6_5 PBS中對(duì)釋放度測(cè)定的千擾試驗(yàn)

由圖1.6可知該酶在波長(zhǎng)265nm處對(duì)主藥的測(cè)定無(wú)吸收干擾峰(A=0.009 )。

Figl.6 The ultraviolet spectrum of galactomannanase in pH6.5PBS.

1.3腸內(nèi)容物法模擬在體結(jié)腸環(huán)境的體外釋放度中5-FU測(cè)定方法——HPLC 方法的評(píng)價(jià) 1.3.1方法的專屬性

5-FU的HPLC圖譜見圖1.7。由圖可知在建立的色譜條件下，5-FU的保 留時(shí)間為6.8min，釋放介質(zhì)對(duì)藥物的測(cè)定無(wú)干擾。

5-FU 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 A=6.0423C+4.4779 (r=0.9999),濃度在 0.5~ 300|_ig/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3回收率和精密度

5-FU在腸內(nèi)容物法模擬結(jié)腸體內(nèi)環(huán)境的釋放度試驗(yàn)中的回收率見表1.6。 測(cè)定方法的日內(nèi)和日間精密度見表1.7。結(jié)果表明，所建立的分析方法準(zhǔn)確.

可靠。

Tabl .6 Accuracy of the determination of 5-fluarouracil in the dissolution media containing rat caecal

contents (n=5).

AddedDetcted

〇g/ml)Accuracy

(%)MeaniSD

(%)RSD

(%)

11.02土0.01102.00

5-FU5049.78土 1.0298.1699.75土 2.002.00

,200198.17 土 2.6799.09

Tab 1.7 Precision of the determination of 5-fluorouracil in rat caecal content-based dissolution test

(n=5).

Added (^ig/ml)Detcted (ng/ml)RSD (%)

t1,01 士0.032.97

With in-day5049.88土 1.252.51

200203.67士 2.561.27

10.97 士 0.022.06

Between-day5051.01 土 1.202.35

200198.37土 3.211.62

1.3.4檢冊(cè)j I1艮

檢測(cè)限為0.25|iig/ml。

2.載藥小丸的評(píng)價(jià)

制備藥物小丸的傳統(tǒng)方法是滾動(dòng)成丸法，但該法的藥物損失大，且小丸 粒度分布不均。目前國(guó)內(nèi)外常采用的方法之一是擠出-滾圓法[22_24]，但該法至 少需要擠壓機(jī)和滾圓機(jī)兩臺(tái)機(jī)器方能完成造丸過(guò)程，且操作繁瑣，投料量相 對(duì)較大。采用流化床對(duì)空白丸芯噴液上藥制備載藥小丸，只要空白丸芯粒徑

均勻，就可得到粒徑分布集中的小丸，并且上藥效率高。本研究使用粒徑范 圍在710-850叫1 (20~24目）的空白丸芯，經(jīng)Glatt流化床上藥后，上藥效 率達(dá)92.40% (上藥效率（％ )=藥物的實(shí)際含量/藥物的理論含量x 1 〇〇% )，粒 徑范圍在18-24目的小丸占99.4% (圖1.8)，小丸的載藥量為28.23%。本 文第一章與第三章的研究均采用同一批載藥丸芯。

測(cè)定載藥小丸在不同介質(zhì)中的溶出度，結(jié)果見圖1.9,栽藥小丸在各介質(zhì) 中均能迅速溶出，5min內(nèi)的溶出量均大于95%,因此載藥丸芯不會(huì)成為阻滯

釋藥的因素。

o o o o

8 6 4 2 %£S-5M

100， 93 4

<2424-2020-18>18

Size range of pellets (mesh)

Fig. 1.8 Size distribution of uncoated pellets of 5-fluorouracil. 100 -rm -—■ i：

-A—0.1MHCI pH6.5PBS —pH6.8PBS l-pH7,4PBS

0102030

Time ( min)

Fig. 1.9 Dissolution behavior of uncoated pellets of 5-fluorouracil.

3.Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的評(píng)價(jià)

3.1瓜爾膠包衣小丸的評(píng)價(jià)

3.1.1包衣液的配制及包衣小丸的制備

瓜爾膠在水中形成粘稍的膠體溶液，粘度過(guò)大和流動(dòng)性不佳使得它在小 丸包衣中無(wú)法通過(guò)端動(dòng)泵和空氣壓縮泵順利噴出，并且噴液后小丸表面不易 干燥易發(fā)生粘連。為了將瓜爾肢應(yīng)用于小丸劑（結(jié)腸靶向的最佳劑型）的包 衣，嘗試不同的方法配制包衣液以降低漿料粘度：1、降低瓜爾肢容液的濃度 直到具有適宜粘度以適用于包衣。2、以PVP的乙醇溶液作為粘合劑將瓜爾膠 分散于其中。3、選擇適宜的瓜爾膠濃度及醇/水比例，將瓜爾膠混懸于水/醇 系統(tǒng)中，形成具有適當(dāng)濃度及粘度的包衣液。結(jié)果表明：方法1、對(duì)于粘度為 5200~5500cps的瓜爾膠而言，其水溶液的來(lái)度要50.25%時(shí)，包衣液的粘度才 足夠小到可以進(jìn)行噴霧包衣操作，但如此低的濃度將導(dǎo)致包衣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。方 法2、瓜爾膠分散于PVP的乙醇溶液中，其包裹于載藥丸芯上的能力完全依賴 于PVP醇溶液的粘度，噴液過(guò)程中瓜爾膠易與PVP溶液分離，被干燥成粉， 不能有效地包覆于小丸表面，此法的包衣效率很低，僅有25.60%。方法3、利 用瓜爾膠不溶于乙醇，遇水則形成粘性膠體的性質(zhì)，通過(guò)加入適量的乙醇， 降低包衣液的粘度。保留下來(lái)的粘性既足夠小，使包衣液可順利噴出；同時(shí) 包衣液的粘附力也足夠大，保證瓜爾膠可以較高的效率包覆于載藥丸芯。本 文最終采用方法3,配置4%的瓜爾膠（W/W)的醇/水（1/4, V/V)混懸液作 為包衣液，在自制流化床中對(duì)栽藥丸芯進(jìn)行噴液包衣，包衣效率為75.81±2.13 % ( RSD=2.25%, n=3 )8

由于包衣液為瓜爾膠的混懸液而非溶液，所以噴霧包衣后形成的衣層并 非連續(xù)的衣膜，而是瓜爾膠顆粒的堆積。根據(jù)近年來(lái)國(guó)外出現(xiàn)的干粉包衣的 原理[2M8]，當(dāng)包衣材料粒子的粒徑小于10[mi以下時(shí)，可通過(guò)加大增塑劑的用 量、升高包衣操作溫度，升高熱處理溫度及延長(zhǎng)熱處理時(shí)間等工藝手段促進(jìn) 衣膜形成。但是瓜爾膠經(jīng)3次氣流粉碎后，粒徑仍然在lOO^m左右，無(wú)法通過(guò) 加劇包衣操作及熱處理?xiàng)l件來(lái)促成衣膜的形成。因此本文沒有考察增塑劑的 種類及用量對(duì)瓜爾膠包衣小丸釋放度的影響。包衣結(jié)束后，小丸在60°C的烘 箱干燥6 h，也僅是為了除去殘留的水分。本文最終選用粒徑盡可能小（300 目）的瓜爾膠作為包衣材料，以使包衣后瓜爾膠可以緊密堆積在小丸表面形 成致密均勻的衣層（見圖1.19B)。

3.1.2酶法與腸內(nèi)容物法對(duì)瓜爾膠水解作用的比較

為了評(píng)價(jià)以瓜爾股為載體的給藥系統(tǒng)的酶促發(fā)釋藥機(jī)制，本文根據(jù)文獻(xiàn) 報(bào)道的方法分別采用加酶（半乳甘露糖苷酶）及腸內(nèi)容物的方法進(jìn)行瓜爾膠 包衣小丸的釋放度考察，結(jié)果見圖1.10。結(jié)果表明，不同濃度的酶和4%的腸 內(nèi)容物均可以加快藥物的釋放，酶濃度越高藥物釋放越快，當(dāng)酶濃度達(dá)到 0.0097U/ml時(shí)與4%的腸內(nèi)容物的酶促釋藥效果相當(dāng)。因腸內(nèi)容物法需要提前 誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生相關(guān)酶、腸內(nèi)容物制備及釋放度試驗(yàn)全程需通氮、并且樣品需 采用HPLC法分析，相比之下酶法具有操作簡(jiǎn)便，樣品分析簡(jiǎn)單迅速的優(yōu)勢(shì),

故本文以后的研究中均采用酶法（(K00968U/ml，pH6.5PBS)來(lái)模擬在體結(jié)腸

一with galactomannanse(0.0024U/mI) — with 4% rat caeca! content

的酶環(huán)境。

0123456789101112

Time (h)

Fig. 1 • U) Release profiles of 5-fluorouracil from guar gum coated pellets in the absence and presence of various concentrations galactomannanase in pH6.5 phosphate buffer and in presence of 4% rat

caecal contents in pH6.8 phosphate buffer.

3.1.3影響釋藥的因素 3.1.3.1瓜爾肢粘度的影響

包被在小丸上的瓜爾膠遇水形成凝膠層，水分逐漸向丸芯滲入，經(jīng)過(guò)一 定時(shí)間后到達(dá)小丸內(nèi)部，潤(rùn)濕載藥丸芯，藥物通過(guò)瓜爾膠凝膠層逐漸釋放到 介質(zhì)中^藥物從載藥層釋放的快慢與包衣層的性質(zhì)密切相關(guān)。本文分別選用 枯度為 900 ~ 1300cps、2600 ~ 3100cps、4000 ~ 4500cps 和 5200 ~ 5500cps 的 瓜爾膠對(duì)載藥小丸包衣，包衣增重均在550%左右。各種枯度的瓜爾膠包衣小 丸的釋放度結(jié)果見圖1.11。瓜爾膠對(duì)藥物釋放的阻礙作用，隨著瓜爾膠粘度 的增大而增大。以T1()(藥物釋放10%所需的時(shí)間）作為參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)瓜爾肢衣 層阻滯藥物釋放的能力，上述4種枯度的瓜爾膠包衣小丸的T1Q分別為5 min、 20 min、40 min和60 min。在本文以后的研究中均采用枯度為5200 ~ 5500cps 的瓜爾肢。

0123456789101112

Time (h)

Fig. 1.11 Release profiles of 5-fluorouracil from pellets coated with guar gum of different viscosity (about 550% coat weight gain) in pH6.5 phosphate buffer.

3.1.3.2瓜爾膠包衣增重的影響

隨著瓜爾膠包衣層厚度的增加，衣層阻礙藥物釋放的能力增強(qiáng)。從圖1.12 可以看出當(dāng)包衣增重達(dá)到580%時(shí)，藥物lh的累計(jì)釋放量為9.08%, 12h的 釋藥量接近100°/〇。與載藥丸芯（圖1.9)相比瓜爾膠衣層可以顯著延緩5-FU

的釋放。

3.1.3.3釋放介質(zhì)pH的影響

瓜爾膠包衣小丸在不同介質(zhì)中的釋放曲線見圖1.13?？梢钥吹剿幬锏尼?放速率與介質(zhì)的pH值無(wú)關(guān)，四條釋放曲線的f2均大于70，這與藥物和瓜爾 股的性質(zhì)有關(guān)，5-FU為水溶性藥物，在四種介質(zhì)中的溶解度均在18mg/ml 左右，而瓜爾膠為非離子型多糖，在pH<10范圍內(nèi)，它遇水形成粘稠膠體 的能力與pH值無(wú)關(guān)[291。 

pH6‘5PBS

s— pH7.4PBS pH6.8PBS 0.1MHCI

02468101214

T ime (h)

Fig. 1.13 Release profiles of 5-fluorouracil from guar gum coated pellets in different dissolution

media.

3.1.3.4瓜爾膠水解酶的影響

圖1.14表明，半乳甘露糖苷酶可以引發(fā)瓜爾膠的降解，與對(duì)照組相比， 在含有半乳甘露糖苷酶的介質(zhì)中，5-FU可以更為迅速地從小丸中釋出。兩條 釋放曲線的色為32,00，差異明顯，

3.2Eudragit FS30D包衣小丸的評(píng)價(jià)

用于口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)的pH敏感材料主要為丙烯酸樹脂，其中 Eudragit S100和EudragitFS30D以其在大于pH 7溶液中溶解的特性，備受研 究者的青睞。近年來(lái)大多數(shù)研究均采用EudragitSlOO,它既可用于有機(jī)溶劑 包衣也可采取水性包衣，但須自行配制水分散體。由于Eudragit S100和 

EudragitFS30D的組成及制備工藝不同，它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中的用法不盡相同。 EudragitSlOO的玻璃轉(zhuǎn)化溫度較高，在進(jìn)行水性包衣時(shí)需加入較多的增塑劑 才能形成連續(xù)緊密的衣膜。以增塑效果最好的檸橡酸三乙酯為例，當(dāng)檸檬酸 三乙酯用量達(dá)到40-50°/。，才能形成完好的衣膜。而對(duì)于EudragitFS30D而言， 商品本身已為水分散體，加水稀釋后即可用于包衣。并且EudragitFS30D的 最低成膜溫度很低僅為14°C,玻璃轉(zhuǎn)化溫度為48°C，因此包衣操作的溫度也 較低在30°C左右即可。由于EudragitFS30D的成膜性好，盡管它為水分散體， 但可以不加或最多加入2-5%梓檬酸三乙酯作為增塑劑?？紤]到包衣操作的方 便性，本研究采用EudragitFS30D作為pH敏感包衣材料。

Eudragit FS30D是固含物為30%的曱基丙烯酸、丙烯酸甲酯和曱基丙烯 酸曱酯（1:1:1)共聚物的水分散體，其溶解閾值為pH27。FS30D包衣液的 配制簡(jiǎn)單，加水稀釋至固含物為10%即可用于包衣。因此僅考察增塑劑、包 衣增重及熱處理時(shí)間對(duì)FS30D包衣小丸釋放度的影響。

3.2.1增塑劑的影響

選用產(chǎn)品推薦的檸檬酸三乙酯為增塑劑，用量分別為5%和0%時(shí)小丸（包 衣增重為20%)在pH值梯度變化的釋放介質(zhì)中的釋藥行為，結(jié)果見圖1.15。 兩條釋放曲線重合，^為93.20，因此在以后的包衣液中均不加增塑劑。

o o o o

0 8 6 4

-■— without TEC -A— with TEC

3.2.2包衣增重的影響

制備包衣增重為19.79%, 31.00%, 39.80%的EudragitFS30D包衣小丸， 基于瓜爾膠包衣的口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)，分別考察它們?cè)?.1mol/L HC1、pH6.8PBS的釋藥行為（圖1.16)及梯度pH 介質(zhì)中(模擬體內(nèi)胃腸道的pH環(huán)境)的釋藥行為（圖1.17)。從圖1.17可以看 出，包衣增重不同的3種小丸在最初的4 h，即2 h 0.1mol/L HC1及2 h

100

80

3

3 60

u

5 40

•FS30D19.79%

-FS30D31.00%

-FS30D39.80%

20

o o o o

8 6 4 2 paseufaj }uauJv&

2

Time (h)

10

Time(h)

pH6.8PBS中均不釋藥。而當(dāng)釋放介質(zhì)更換為pH 7.4PBS后，藥物在0.5 h時(shí) 的累計(jì)釋放量均已達(dá)到97%。圖1.16A、B進(jìn)一步表明了 3種包衣增重的 Eudragit FS30D 衣膜在 O.lmol/L HC1 及 pH6.8PBS 中耐受情況。在 O.lmol/L HC1中，Eudragit FS30D衣膜至少可以耐受8 h, 12 h的累計(jì)釋放量也僅達(dá)到 5 %左右。在pH6.8PBS中，Eudragit FS30D衣膜可以保護(hù)藥物不釋放至少8 h, 而在8h之后，隨著衣膜厚度的減小，藥物的釋放量增加，但對(duì)于增重31.00 %和39.80 %的包衣小丸而言，在12h的累計(jì)釋放量也僅達(dá)到5 %左右。

Fig. 1.16 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets (A) in O.lmol/L HC1, 12h; (B)

100

o o o o

8 6 4 2

pdsBwPJ ISUJ3Q,

■FS30DI9.79%

-FSJ0D31.00%

-FS30D39.80%

in pH6.8 PBS, 12h.

0123456

Time (h)

Fig. 1.17 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh).

以上試驗(yàn)結(jié)果可以看出，Eudragit FS30D作為一種pH敏感包衣材料（pH 閾值為7，即在pH>7的環(huán)境下容解）對(duì)環(huán)境的pH的響應(yīng)很靈敏，它可以保 護(hù)藥物在低于其溶解閾值以下的pH環(huán)境不釋放，而在高于溶解閾值的pH環(huán) 境中衣膜快速容解，藥物迅速釋出。在本文以后的試驗(yàn)中，固定Eudragit FS30D包衣增重在30°/<u

于40°C分別對(duì)包衣增重為30%的小丸進(jìn)行0、2、6和12 h的熱處理后 進(jìn)行藥物釋放度的測(cè)定，結(jié)果見圖1.18。未作熱處理的包衣小丸4h的釋藥量 在8%左右，而熱處理2h、6h和12h后小丸的釋放曲線基本重合，4h的累計(jì) 釋藥量均小于1%,表明40。(：下熱處理2h即可使膜完全愈合。因此如無(wú)特殊 說(shuō)明，本文中的EudragitFS30D包衣小丸均采用2h的熱處理工藝。

Time (h)

Fig. 1.18 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets with different thermal curing time in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh).

3.3Eudragh FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸的性狀及體外釋藥評(píng)價(jià)

圖1.19A為EudragitFS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸在電鏡下的剖面圖。從 圖中可以看到載藥層致密均勻；Eudragit FS30D衣層為光滑、連續(xù)的衣膜， 相比之下瓜爾膠衣層略顯疏松且呈不連續(xù)狀態(tài)，這與瓜爾膠和Eudragit FS30D衣層的性質(zhì)密切相關(guān)，前者僅為瓜爾膠顆粒的堆積，而后者則形成了 完整、連續(xù)的衣膜。

outer enteric coat^. (Eudragit FS30D)

Inner coat (guar guin)^

drug-loaded layer♦ Inert nonpareil ♦

Fig. 1.19 Scanning electron micrographs of the cross-section of the pellet coated with Eudragit FS30D and guar gum (A) and the surface of guar gum-coated pellet (without outer enteric coating) before (B) and during (C) release test at a magnification of 100 folds.

r

00

o o o o

8 6 4 2 P3SSPJ lu9oJ<s>a.

0246810121416

Time (h)

——A一 FS30D/GG without g^lactomannanse —■一- FS30D/GGwith galactomannanse —uncoated—©— FS30D

Fig. 1.20 Release profiles of 5-fluorouracil from uncoated, Eudragit FS30D coated and Eudragit FS30D and guar gum (GG) double coated pellets in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh; pH6.5, lOh) with (9.68>^10'3U/ml) and without

galactomannanase.

圖1.20展現(xiàn)了在模擬胃腸道pH梯度介質(zhì)中栽藥小丸、Eudragit FS30D 包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸的釋藥曲線。作為水溶性藥 物,5-FU在0.lmol/L HC1中5min左右即完全從栽藥丸芯中釋放出來(lái);Eudragit FS30D包衣小丸在4h的釋藥時(shí)滯后，受釋藥介質(zhì)pH值的促發(fā)FS30D衣膜迅 速溶解，并在30min內(nèi)釋藥97%左右。由此可見憑借Eudragit FS30D衣層可 以有效、迅速的實(shí)現(xiàn)pH促發(fā)藥物釋放。但是消化道的生理特點(diǎn)降低了這種 簡(jiǎn)單易行促發(fā)機(jī)制實(shí)際的有效性，即單純使用Eudragit FS30D包衣會(huì)造成藥 物在結(jié)腸前的提早釋放，這可能會(huì)引起副作用的增加及治療的失敗。而借助 于內(nèi)衣層瓜爾膠的保護(hù)，Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸在進(jìn)入 PH7.4PBS后藥物并不會(huì)迅速釋出，大約lh后藥物開始釋放，釋藥時(shí)滯共為

5h。時(shí)滯之后小丸進(jìn)入模擬結(jié)腸的釋放介廣中，無(wú)酶存在時(shí)瓜爾膠繼續(xù)阻止 藥物的釋放，在此后10h的釋藥量達(dá)80%左右，而當(dāng)有瓜爾膠水解酶存在時(shí)， 時(shí)滯后lh的釋藥量就達(dá)到65%左右，并在此后的4h釋藥完全，酶促釋藥效

果顯著。

4.體內(nèi)分析方法的評(píng)價(jià)

4.1方法的專屬性

5-FU的HPLC圖譜見圖1.21。由圖可知在建立的色譜條件下，5-FU和 內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為6.4min和14.9min，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)藥物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定

無(wú)干擾。

4,2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

5-FU 血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 R=0.0003238C-0.0001716 (1=0.9996), 血藥濃度在20 ~ 800ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.3方法精密度

Tabl.8 Precision of the determination of 5-fluorouracil in dog^ plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdeteeted (ng/ml )RSD(°/〇)

5051.01 土 1.823.57

Within-day200207.89士 8.514.09

600612.39±25.384.14

5050.87± 1.843.62

Between-day200206.76^9.124.41

600610.05土】9 石5322

4.4方法回收率

Tab 1.9 Accuracy of the determination of 5-fluorouracil in dog’s plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdeiected (ng/ml)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

5051.01±1.82102.02

200207.89 士 8.51104.95103.01 士 1.681.63

600612.39 土 25.38102.07

 

Tabl. 10 Extraction recovery of the determination of 5-fluorouracil in dog’s plasma (n^S).

c (ng/ml)Extraction recovery (%)Mean 土 SDRSD (%)

5071,38

20070.0972.03 ± 2.343.25

60074.63

4.6最低定量限

最低定量限為20ng/ml 4.7檢測(cè)限

檢測(cè)限為10ng/ml。

5.Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣的5-FU小丸犬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究

5.1血藥濃度及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

犬口服5-FU載藥小丸、Eudragit FS30D包衣小丸和Eudragit FS30D/瓜爾 股雙層包衣小丸后的血藥濃度數(shù)據(jù)分別見表1.11、表1.12和表1.13,平均血 藥濃度-時(shí)間曲線圖見圖1.22，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1.14。

Tab. 1.11 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of uncoated

pellets (n=5)

TimeNo. of subjectsX土 SD

(h)12345

0000000

0,0833044.40028.2129.5220.43±19.70

0.25138.22160.6229.64152.23122.43160.63士41.21

0.5319.50366.6317.93318.96336.99331.88 土 20.64

0.7590.2385.8255.6885.02130.1889.39土 26.61

128.7323.85021.3666.7728.13 士 24.21

1.5000025.615.55 土 11.21

2000000

2.5000000

3000000

4000000

5000000

7000000

9000000

Tab. 1.12 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in beagle dog after oral administration ofFS30D coated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjects

12345

000000

100000

254,6400069.30

30102.63100.8494.700

400000

500000

600000

700000

800000

1000000

1200000

2400000

Tab. 1.13 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in beagle dog after oral administration ofFS30D/GG double coated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

000000

i00000

200000

300000

400000

500000

600041.270

749.44 0000

8065.6139.79071.75

1000000

1200000

2400000

Tabl. 14. Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of 5-fluorouracil iii beagle dogs (n=5) after oral administration of (dose 50 mg) of 5-FU formulations.

parametersUncoated pelletsFS30D coated pelletsFS30D/GG coated pellets

Cmax (ng/ml)332.00 土 20.8984.42±21.3453.57±14.44 *

T,nax (h)0.50±0.002.6 土 0.557.4±0.89 * *

vs uncoated pellets, at P<0.01; # vs FS30D coated pellets, at P<0.01

從表1.14可以看出3種小丸體內(nèi)行為明顯不同。FS30D包衣小丸和 FS30D/瓜爾肢雙層包衣小丸的Tn^分別為2.6h和7.4h明顯長(zhǎng)于栽藥丸芯 (0.5h ); Cmax分別為84.42ng/ml和53.57ng/ml也遠(yuǎn)低于載藥丸芯 (332.00ng/ml )。由此可以看出兩種包衣的小丸均可不同程度地延緩藥物的釋 放，其中FS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的延緩效果更為顯著。

由于FS30D包衣小丸和FS30D/瓜爾膠雙層包衣小丸均只測(cè)得一個(gè)時(shí)間 點(diǎn)的血藥濃度，因此在圖1.22中僅對(duì)栽藥丸芯做藥-時(shí)曲線圖，而對(duì)于FS30D 包衣小丸和FS30D/瓜爾膠包衣小丸分別以不同時(shí)間下實(shí)際檢出的平均血藥 濃度柱狀圖表示藥物進(jìn)入體循環(huán)的時(shí)間及濃度。雖然無(wú)法得到AUC和Tlag等 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，但從圖1.22可以看出：與5min后藥物即進(jìn)入體循環(huán)的速釋栽 藥丸芯相比，F(xiàn)S30D包衣小丸可延緩藥物釋放，但釋藥時(shí)滯過(guò)短僅為2~3h 左右，意味著藥物在到達(dá)結(jié)腸前便被釋出，無(wú)法有效實(shí)現(xiàn)結(jié)腸靶向釋藥的目 的；而雙重包衣小丸的口服吸收時(shí)滯在6~8h,與體外5h釋藥時(shí)滯接近，說(shuō) 明雙層包衣可以保護(hù)藥物安全通過(guò)胃及小腸，到達(dá)結(jié)腸后才開始釋放藥物， 因此FS30D/瓜爾肢雙層包衣小丸具有較好的結(jié)腸定位釋藥特性。

5.2討論

EudragitFS30D包衣小丸的體外釋藥時(shí)滯■為4h，而犬口服EudragitFS30D 包衣小丸后最早于2 h在血中檢出藥物，表明小丸很快到達(dá)pH值>7環(huán)境， 衣膜溶解，藥物釋出。犬口服Eudragit FS30D/GG雙重包衣小丸后最早于給 藥后第6h在血中檢出現(xiàn)藥物，與體外5h的釋藥時(shí)滯接近。體外試驗(yàn)中，兩

種包衣小丸的釋藥時(shí)滯僅差lh，體內(nèi)試驗(yàn):卻有4h的區(qū)別，這可能與體內(nèi)的 腸液量遠(yuǎn)小于體外試驗(yàn)有關(guān)，瓜爾膠吸水凝膠化速度變慢，因此同樣厚度的 瓜爾膠衣層可在Eudragit FS30D衣膜溶解后更長(zhǎng)時(shí)間保護(hù)藥物不釋放，直至 小丸轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸酶降解瓜爾膠，藥物釋出。

用于評(píng)價(jià)結(jié)腸靶向釋藥系統(tǒng)的動(dòng)物應(yīng)在解剖學(xué)和生理學(xué)以及腸道微菌群 上與人密切相似。目前開發(fā)OCDDS的研究報(bào)道多選用大鼠、豚鼠和狗等動(dòng) 物進(jìn)行^，3(W4]。豚鼠因具有與人相似的結(jié)腸微菌群及相關(guān)酶系，被認(rèn)為是最合 適作為生物可降解型OCDDS體內(nèi)研究的動(dòng)物模型，但因豚鼠胃排空較慢故 不常采用。本研究中曾經(jīng)采用大鼠為模型動(dòng)物，但由于一個(gè)劑量的小丸過(guò)多， 大鼠胃排空的速度極大減慢，因此最終選擇了犬作為體內(nèi)評(píng)價(jià)的試驗(yàn)動(dòng)物。

證明藥物結(jié)腸靶向的最直觀可靠的方法是利用y-閃爍掃描法進(jìn)行檢測(cè)， 因大多數(shù)藥物不含有適于Y-閃爍掃描研究的同位素，而需先標(biāo)記藥物或?qū)⒎?射性物質(zhì)（如99mTc、ulIn)加入制劑。放射性同位素有固定的半衰期，因此 要求制劑的制備工藝簡(jiǎn)單，制備周期短，并且應(yīng)盡快進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。本研究 選用的是小丸劑，包衣過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，并且與單一的固體制劑不同，小丸在 胃腸道中分散較廣，判斷小丸的位置較為困難，鑒于這些原因，本文沒有進(jìn) 行制劑的胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)行為的研究。

4.小結(jié)

結(jié)腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，癌癥死亡的第二大主因，目前 一線化療藥物仍為5-FU的注射劑。5-FU0CDDS的成功研制將可以降低或消 除藥物在胃和小腸的吸收，提高病患局部的藥物濃度，減少或避免藥物進(jìn)入 體循環(huán)引起的全身毒副反應(yīng)，？文善5-FU對(duì)結(jié)腸癌的臨床治療效果。另外，水 溶性藥物由于落解度大易導(dǎo)致藥物過(guò)早釋放一直是OCDDS研究中的難點(diǎn)， 5-FU為水溶性藥物，基于瓜爾膠包衣的口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)，溶解度約為18mg/ml (溶解度與介質(zhì)的pH無(wú)關(guān)），其 OCDDS的成功研制為其它藥物OCDDS的設(shè)計(jì)提供了可行有效的新思路。

本章采取pH敏感-酶促發(fā)雙重策略，分別用pH敏感材料Eudragit FS30D 和可生物降解的天然多糖瓜爾膠對(duì)栽藥小丸進(jìn)行雙層包衣。體內(nèi)、外試驗(yàn)結(jié) 果表明雙層包衣小丸的釋藥時(shí)滯均在5-6h左右，表明雙層包衣可保護(hù)藥物安 全通過(guò)上消化道，到達(dá)結(jié)腸后開始釋藥。兩種釋藥機(jī)制的共同控制使得5-FU 靶向于結(jié)腸釋藥更安全、有效^

本研究中選用了水溶液粘度最大的瓜爾膠作為可生物降解材料，采用瓜 爾肢醇/水混懸液噴霧包衣的工藝成功地將瓜爾膠包覆于栽藥小丸，解決了親 水性高分子材料難以用于小丸劑包衣的難題。

結(jié)腸靶向釋藥技術(shù)的關(guān)鍵在于保護(hù)藥物到達(dá)結(jié)腸后釋放，即給藥系統(tǒng)需 克服胃和小腸平均5h的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程不釋藥。除了釋藥機(jī)制外，藥物的溶解性 質(zhì)也成為給藥系統(tǒng)成功與否的關(guān)鍵。水溶性藥物的溶解度大，易被溶解后擴(kuò) 散進(jìn)入介質(zhì)，往往造成藥物的提前釋放[1_2]。難溶性藥物的溶解度小，更易實(shí) 現(xiàn)5 h左右的釋藥時(shí)滯，但是較低的溶解度有時(shí)會(huì)引起藥物進(jìn)入結(jié)腸后釋放 過(guò)慢甚至釋放不完全[>4]。第一章以5-FU為水溶性模型藥物，制備并評(píng)價(jià) Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包衣的結(jié)腸定位釋藥小丸，本章以難溶性藥物吲 哚美辛為代表，采用相同的設(shè)計(jì)策略制備結(jié)腸定位釋藥小丸，考察體內(nèi)外釋 藥行為，評(píng)價(jià)其結(jié)腸靶向性。通過(guò)比較5-FU和吲咮美辛2種結(jié)腸定位釋藥 小丸的處方組成及體內(nèi)外釋藥行為，評(píng)價(jià)基于Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包 衣的pH敏感-酶促發(fā)雙重控制的結(jié)腸定位釋藥小丸的可行性。

Fluka Biochemika 內(nèi)蒙古赤峰藥業(yè) Merck公司

江蘇太倉(cāng)制藥廠 國(guó)際特品（香港）有限公司 上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站 上海Colorcon包衣技術(shù)有限公司 法國(guó)NP Phami公司 法國(guó)Rhodia公司 degussa R6hm 公司

(Eudragit FS30D)

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg) 萘普生（內(nèi)標(biāo)）

乙睛（色譜純）

1.材料

吲味美辛(批號(hào)020961)

聚乙烯吡咯烷酮（PVP^o)

聚乙二醇（PEG4000)

羥丙曱纖維素（HPMC, 5cPa-s) 蔗糖丸芯（PF101，710-850叫1) 瓜爾膠（guargum)

腸溶型丙烯酸樹脂水分散體德國(guó)

1.材料與儀器

用于HPLC的試劑為色譜純，鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉、 冰醋酸、梓橡酸等其他試劑均為分析純

2.儀器

JGM-H50氣流粉碎機(jī)華東理工大學(xué)

UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)日本島津

BS210S 電子天平Sartorius

Sartorius

BS610S電子天平

85-2型恒溫磁力攪拌器

上海智威電器有限公司 自制

德國(guó)Glatt公司 浙江溫嶺市潘郎鼓風(fēng)機(jī)廠 寧波石浦海天電子儀器廠 天津大學(xué)無(wú)線電廠 曰本Hitachi公司 德國(guó)安杰倫公司

微型流化包衣設(shè)備

GPCG1.1型流化包衣機(jī)

藍(lán)森牌離心式單相交流鼓風(fēng)機(jī)

DDB-320多功能電子蠕動(dòng)泵

ZRS-8G智能溶出儀

S-520掃描電子顯微鏡

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀

(G1322ADEGASSER, G1311AQuatPump, G1313AALS, G1315B DAD) XW-80型旋渦混合器上海超聲波儀器廠

3•動(dòng)物

Beagle犬，3，8.0±2.0kg,普通級(jí)上海市新岡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)

2.實(shí)驗(yàn)方法

1.體外分析方法的建立

1.1IDM小丸的含量測(cè)定HPLC方法的建立 1.1，1色譜條件

色譜柱：VenusilXBPM-C18(4.6mmxl50mm，5(im)

流動(dòng)相：乙腈：0.1M醋酸納緩沖液（pH5.0) = 40:60 流速：1.0mL/min 柱溫：40°C 檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm 進(jìn)樣量：20ul

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取IDM 50mg，加8ml曱醇超聲溶解后用pH7.4 PBS定容于250ml 量瓶，作為鮮備液。分別吸取一定體積的貯備液，作不同倍數(shù)的稀釋，所得 濃度（C)分別為 0.1、0.5、1、5、10、20、的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC 法 測(cè)定，以藥物峰面積（A)對(duì)濃度（C，pg/ml)作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方

程。

U.3回收率試驗(yàn)

精密稱取IDM 20、25、30 mg及處方量輔料各三份，置250 mL量瓶中， 加適量甲醇超聲溶解后用pH7,4 PBS定容至刻度，離心，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 倍稀釋后，HPLC法測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物的含量，與加入量比較， 計(jì)算回收率。

1.1.4精密度試驗(yàn)

分別吸取一定體積的貯備液，作不同倍數(shù)的稀釋，所得濃度（C)分別為 0.5、5、20嗎/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次及連續(xù)5天測(cè)定，分 別計(jì)算日內(nèi)差、日間差。

1.1.5溶液的穩(wěn)定性

濃度為0.5、5、2〇ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下放置不同時(shí)刻后進(jìn)樣，測(cè) 定冷面積，考察該溶液的穩(wěn)定性。

1.1.6小丸含量測(cè)定

精密稱取相當(dāng)于含IDM 25mg的小丸，在研缽中加適量的pH7.4 PBS后 充分研磨至完全溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，加入適量曱醇超聲后用pH7.4 PBS定容。離心(3500rpm，15min)、過(guò)濾，續(xù)濾液稀釋后，HPLC法測(cè)定，

按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物的含量。

1.2吲咮美辛小丸體外釋放度測(cè)定HPLC方法的建立

1.2.1色譜條件（見本章實(shí)驗(yàn)方法1.1 )

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取 IDM 50 mg,別用 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 定容，

吸取一定體積的溶液，作不同倍數(shù)的稀釋，HPLC法測(cè)定，以藥物峰面積（A) 對(duì)濃度（C, pg/ml)作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.3釋藥介質(zhì)中的穩(wěn)定性（37°C)

釋藥標(biāo)準(zhǔn)曲線上高、中、低三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，分別于不同時(shí)刻進(jìn)樣測(cè) 定峰面積，考察釋藥過(guò)程藥物的穩(wěn)定性。

1.2.4釋藥回收率試驗(yàn)

精密稱取IDM 50 mg置于100 ml量瓶中，再稱取相當(dāng)于一個(gè)劑量的輔料 加入到上述量瓶中，分別加入0.1MHC1、pH6.8、pH7.4和pH6.5PBS,超聲

后定容。分別吸取一定體積的溶液，作不同倍數(shù)的稀釋，HPLC法測(cè)定，以 測(cè)得的量和加入的量比較，計(jì)算回收率。 1.2.5精密度試驗(yàn)

釋藥標(biāo)準(zhǔn)曲線上高、中、低三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5 次及連續(xù)5天測(cè)定，分別計(jì)算日內(nèi)差、日間差。

1.2.6檢測(cè)限

用已知濃度的樣品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，按信嗓 比S/N=3時(shí)相應(yīng)濃度確定檢測(cè)限。

2.載藥小丸的制備

2.1藥物的微粉化

采用水混懸液噴霧上藥，為了均勾上藥及防止混懸液中的固體顆粒堵塞 噴嘴，上藥前IDM經(jīng)氣流粉碎機(jī)微粉化，粒徑<10叫1。

2.2載藥丸芯的制備

用微型流化床預(yù)試空白丸芯混懸上藥的處方和工藝后，用GPCG1.1型 Glatt流化床制備栽藥丸芯。將粘合劑PVP溶于水中（6%, W/V),攪拌下將 微粉化的藥物分散于其中制成混懸液，即可用于噴液上藥。上藥過(guò)程中需要 連續(xù)攪拌藥物混懸液。載藥丸芯的制備工藝如下：

微型流化床：空白丸芯10g，噴嘴直徑0.5mm,控制出口溫度41-44°C， 噴液速率l.Oml/min，在固定的風(fēng)量和霧化壓力下進(jìn)行噴液上藥。

Glatt流化床：空白丸芯lOOOg,底噴法，噴嘴直徑1mm,進(jìn)風(fēng)溫度65°C， 物料溫度51°C，流化風(fēng)量110-116m3/h，噴霧•壓力1.5bar，噴液速率10-12g/min。 載藥結(jié)束后，繼續(xù)流化干燥5min，接著包一層HPMC隔離衣，增重約為2 % (W/W),防止小丸在貯存過(guò)程中粘結(jié)。最終制得小丸約1424g。用篩析法 通過(guò)稱重測(cè)定小九的粒徑分布，篩取18-24目的小丸用于包衣。

3.EudragitFS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的制備、釋藥影響因素及體夕卜評(píng)價(jià)

依次用粘度為5200 ~ 5500cps的瓜爾膠和Eudragit FS30D對(duì)H)M載藥丸 芯進(jìn)行包衣。與第一章相同，雙層衣保護(hù)藥物通過(guò)胃和小腸至結(jié)腸后，酶促 發(fā)瓜爾膠水解，藥物釋出。由于IDM為難溶性藥物，期望較薄的瓜爾膠衣層 即達(dá)到同樣的保護(hù)作用„

3.1瓜爾膠包衣小丸的制備及釋藥影響因素

3.U包衣液的配制（同本文第一章實(shí)驗(yàn)方法中的3.U)

3.1.2小丸包衣（同本文第一章實(shí)驗(yàn)方法中的3.1.2)

3.1.3釋放度試驗(yàn)

按中國(guó)藥典2005版規(guī)定的轉(zhuǎn)籃法測(cè)定。稱取適量包衣小丸（含IDM 25mg)，裝于轉(zhuǎn)籃中，置于900ml恒溫37±0.5°C的的釋放介質(zhì)中，轉(zhuǎn)速為75 rpm，定時(shí)取樣5ml,同時(shí)補(bǔ)充等量同溫的新鮮介廣。樣品經(jīng)0.45阿微孔濾 膜過(guò)濾后，續(xù)濾液經(jīng)HPLC法測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物的累計(jì)釋放百分

率（Q )。

分別以 0.1mol/L HC1、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作為模擬胃、 小腸中前段（十二直腸和空腸）、小腸后段（回腸）及結(jié)腸pH環(huán)境的釋放介 質(zhì)。含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS模擬在體結(jié)腸的酶環(huán)

境。

3.1.4釋藥影響因素

第一章中以5-FU為模型藥考察了瓜爾膠粘度對(duì)瓜爾膠包衣小丸釋藥行 為的影響，粘度在5200~ 5500cps時(shí)瓜爾膠衣層對(duì)藥物的阻滯能力最強(qiáng)，因 此在本章中重點(diǎn)考察包衣增重及釋放介質(zhì)對(duì)瓜爾膠包衣小丸釋藥行為的影

響。

3.1.4.1瓜爾膠包衣增重的影響

考察不同包衣增重下小丸的釋放度。

3.1.4.2釋藥介質(zhì)pH的影響

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 四種釋放介質(zhì)對(duì)

瓜爾肢包衣小丸釋放度的影響。

3.1.4.3瓜爾膠水解酶的影響

考察瓜爾膠包衣小丸在含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS

中的釋藥行為。 3.2EudragitFS30D包衣小丸的制備

本文第一章已經(jīng)以5-FU為模型藥物對(duì)FS30D包衣小丸進(jìn)行的篩選和評(píng) 價(jià)，在本章中依照第一章確定的包衣工藝對(duì)IDM載藥丸芯進(jìn)行包衣及熱處 理，包衣增重至30%，并驗(yàn)證包衣小丸在pH梯度的釋放介質(zhì)中（0.1mol/L HC1,

2h、pH6.8PBS，2h和 pH7.4PBS, lh)的釋藥行為。

3.3Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的制備及體外釋藥評(píng)價(jià) 3.3.1小丸的包衣

依次按本章實(shí)驗(yàn)方法中3.1.2和3.2項(xiàng)下的操作對(duì)載藥丸芯進(jìn)行瓜爾膠內(nèi) 層包衣及Eudragit FS30D外層包衣，包衣增重分別為44%和SO%.

3.3.2釋放度試驗(yàn)

轉(zhuǎn)籃法測(cè)定。余下操作同3.1.3項(xiàng)下所述。分別以0.1mol/LHCl(2h)、 pH6.8 PBS(2 h)、pH7.4 PBS(1 h)和 pH6.5 PBS(12 h)作為釋放介質(zhì)，模擬胃、 小腸中前段（十二直腸和空腸）、小腸后段（回腸）及結(jié)腸的pH環(huán)境。pH6.5 PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.0097U/ml)模擬在體結(jié)腸的酶環(huán)境。

4.掃描電鏡觀察

用掃描電鏡觀察FS30D/GG雙層包衣小丸的剖面結(jié)構(gòu)。

5.體內(nèi)分析方法的建立

IDM是臨床上常用的消炎鎮(zhèn)痛藥物，測(cè)定IDM血藥濃度的方法主要為 高效液相色譜法(HPLC)。本文參考文獻(xiàn)報(bào)道的分析方法[51，采用下述的反相 高效液相色譜法測(cè)定犬口服IDM制劑后的血藥濃度。

5.1色譜條件

色譜柱：VenusilXBPM-C18(4_6mmxl50mm，5(xm)

流動(dòng)相：乙腈：0.1M醋酸鈉緩沖液（pH5.0) = 40:60 流* 速：1 .OmL/min 柱溫：40°C 檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm 內(nèi)標(biāo)：萘普生(10(ig/ml)

進(jìn)樣量：20ul

記錄IDM與萘普生的峰面積比為響應(yīng)參數(shù)，內(nèi)標(biāo)法定量。

5.2血漿樣品處理方法

精密吸取犬血漿500^1,萘普生(10pg/ml)10〇nl, 2%杵橡酸500叫于15ml 離心管，加入5ml乙謎，旋渦混合5 min,離心15min (3500rpm),取上層有機(jī) 層于5ml潔凈離心管中，于40°C水浴中用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)胠OOfil流動(dòng)相溶

解，離心后取20pl進(jìn)樣分析。 5.3血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取犬血漿50(Hil，加入IDM標(biāo)準(zhǔn)溶液（100^1),使?jié)舛确謩e為50、 100、250、500、1000、2500、6000ng/ml,加入內(nèi)標(biāo)的方法同上，按血樣品 處理方法操作，以HPLC法測(cè)定，基于瓜爾膠包衣的口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)，以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值R( A1DM/A 茶普生）對(duì)樣品濃度（C_)作線性回歸，求回歸方程。

5.4血藥濃度分析方法的評(píng)價(jià)

5.4.1方法精密度

取空白血漿5004數(shù)份，加入IDM標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為50、500、 2500ng/ml,加入100^1內(nèi)標(biāo)溶液，按血漿處理方法操作并作色譜分析。一天 內(nèi)重復(fù)五次，統(tǒng)計(jì)測(cè)定數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD,即為方法的天內(nèi)精密度。 連續(xù)五天重復(fù)操作，統(tǒng)計(jì)測(cè)得數(shù)據(jù)的RSD，即為方法的天間精密度。

5.4.2方法回收率

取空白血漿500^1數(shù)份，加入5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為50、500、 2500ng/ml，加入100^1內(nèi)標(biāo)溶液，每一濃度配置五份樣品，按血漿處理方法 操作并作色譜分析，以測(cè)得的濃度對(duì)實(shí)際濃度之比計(jì)算方法回收率。

5.4.3提取回收率

取空白血漿500^1數(shù)份，加入5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為50、500、 2500ng/ml,每一濃度配置五份樣品，按血漿處理方法操作并作色譜分析，分 別與同濃度的5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣的峰面積做比較，計(jì)算方法回收率。

5.4.4檢須扦艮

用已知濃度的樣品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，按信噪 比S/N=3時(shí)相應(yīng)濃度確定檢測(cè)限。

5.4.5最低定量限

樣品中被測(cè)物能夠被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)滿足一定的準(zhǔn)確 度和精密度（兄狀20 % ,這20 % ,測(cè)定偏差E = (C *rC標(biāo))/C標(biāo)xi〇〇 % )。

6.Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣的IDM小丸在犬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究

6.1研究對(duì)象

Beagle犬5只，丄8.0±2.0kg,普通級(jí)

6.2試驗(yàn)制劑與參比制劑

受試制劑：FS30D/GG雙重包衣小丸：FS30D層包衣增重30%, GG層包衣 增重44%。

參比制劑：載藥小丸

FS30D包衣小丸，包衣增重30%。

6.3試驗(yàn)設(shè)計(jì) 服藥方法：

采用自身對(duì)照交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，洗凈期為1周。5只犬，禁食過(guò)夜（18h), 次曰清晨空腹給藥(含IDM 25mg)，用10ml水灌胃。由于本章Eudragit FS30D/ 瓜爾肢雙重包衣小丸和后文第四章中瓜爾肢-乙基纖維素包衣小丸的犬體內(nèi) 藥物動(dòng)力學(xué)研究均以IDM載藥小丸為參比制劑，因此兩部分藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 一起冗成。服藥方案見表2.1。

Tab2.1 Design of administration method of subjects receiving four formulations.

SubjectPhase of administration

iiimIV

IABCD

2BCDA

3CDAB

4DABC

5ACBD

Aruncoated pelletsB: FS30D coated pellets

C: FS30D/GG doubble coated pellets D: GG-EC mixed coated pellets

羊采集：

于服藥前后設(shè)定的時(shí)間從前肢靜脈取血1.2ml,置于肝素鈉離心管中， 8000rpm離心lOmin，取上清血槳于-20°C冷凍保存，待分析。

服用載藥小丸的取樣時(shí)間點(diǎn)：20min、40min、60min、1.5h、2h、3h、4h、 6h、 8h、 10h、 12h。

服用FS30D包衣小丸的取樣時(shí)間點(diǎn)：lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、 10h、 12h、 24h、 30h。

服用FS30D/GG雙重包衣小丸的取樣時(shí)間點(diǎn)：lh、2h、3h、4h、5h、6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h、 30h。

樣品分析方法:

用本文建立的HPLC法測(cè)定血漿中的IDM濃度.

6.4數(shù)據(jù)處理

用梯形法計(jì)算AUC,實(shí)測(cè)法讀取*Tmax，用3p87軟件計(jì)算(Lagtime， Tlag)及平均滯留時(shí)間（MRT)，用t檢驗(yàn)法對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差分析(方差 分析時(shí)AUC和C_經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）。

3.結(jié)果與討論

1.體外分析方法的評(píng)價(jià)

1.1IDM含量測(cè)定分析方法的評(píng)價(jià) 1.1.1含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，IDM在0.1 ~ 40pg/ml的范圍內(nèi)，藥物峰面 積和濃度的線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=26.6667C+0.5680 (尸0.9994)

1.1.2回收率試驗(yàn) 結(jié)果見表2.2

Tab2.2 Accuracy of indomethacin in pH7.4 PBS.

Cadded (Hg’ml) Cdetected (終&^1)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD(%)

87.86. 士 0.1198.25

1010.13±0.14101.30100.52± 1.991.98

1212.24 士 0.18102.00

1.1.3精密度試驗(yàn)

Tab2.3 Precision of the determination of indomethacin in pellets. (n=5).

AddedDetctedRSD

(n_)(Hg/ml)(%)

0.50.49±0.036.12

Within-day55.05 士 0.09L78

2020.78士 0.231.11

0.50.50 土 0.024.00

Between-day54,94 士 0.122.43

2019.86i〇.432.17

1.1.4 IDM穩(wěn)定性試驗(yàn)

濃度為0.5、5、2〇ng/ml的IDM標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下放置0 h、6 h、12 h 后HPLC法測(cè)定，考察該溶液的穩(wěn)定性。

Tab2.4 Stabality of indomethacin in pH7.4PBS through 24h (n=3).

AddedDetcted (^g/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h12 hMean iSD

0.50.520.490.470.49 士 0.036.12

55.044.924.904.95 土 0.081.61

2019.9819.8519.7619.86 士 0.110.56

表明IDM在pH7.4PBS中12h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2IDM小丸體外釋放度測(cè)定方法的評(píng)價(jià) 1.2.1釋藥標(biāo)準(zhǔn)曲線

四種釋放介質(zhì)中，IDM吸收度和濃度的線性曲線方程分別為： 0.1MHC1A=26.0417C+2.2813 (r=0.9998)濃度范圍：0.1 ~ 8pg/ml

0.1 ~ 40j^g/ml 0.1 ~40^g/ml 0.1 ?40 卩 g/ml

pH6.8PBSA=27.5482C+2.1322 (r=0.9997)濃度范圍

pH6.5PBSA=27.0270C+0.4216(r=0.9996)濃度范圍

pH7.4PBSA=26.6667C+0.5680(r=0.9994)濃度范圍

1.2.2IDM在釋藥介質(zhì)中的穩(wěn)定性考察

37。(：水浴下不同時(shí)間IDM在四種釋放介質(zhì)中的濃度見表2.5。

Tab2.5 Concentration of indomethacin in different dissolution media at different time (n=3).

O.lMHCi

AddedDetcted(M_)RSD

(Hg/ml)Oh2h4hMean ±SD

0.50.520.490.460.49 土 0.036.12

22.001.861.821 廉 0.094.76

88.017.857.517.79 士 0.263.34

pH6.8PBS

AddedDetcted(Hg/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h20 hMean 土 SD

0.50.520.500.470.50 士 0.036.00

55.015.014.95499 士 0.030,60

2020.0419.9519.8619.95±0.090.45

 

AddedDetcted (|ig/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h20 hMean ±SD

0.50.510.490.460.49 土 0.036.12

55.025.025.075.04 士 0.030.60

2019.7619.6719.7219.72 士 0.050.25

pH7.4PBS

AddedDetcted (ng/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h .20 hMean ±SD

0.50.510.500.470.49 土 0.024.08

55.055.035.005.03士0.030.60

2019.8719.8519.7619.82 士 0.060.30

表明IDM在體外釋放度試驗(yàn)過(guò)程中穩(wěn)定性良好，分析方法有效可行。

1.2.3釋藥回收率及精密度試驗(yàn)

IDM釋藥回收率見表2.6。測(cè)定方法的日內(nèi)和日間精密度見表2.7。結(jié)果

表明，所建立的分析方法準(zhǔn)確、可靠。

Tab2.6 Accuracy of indoraethacin in defferent dissolution media.

Cadded Hg/ml)C detectedAccuracy (%)Mean 土 SD RSD(%)

0.50.49 士 0.0398.00

0.1MHC122.05 士 0,08102.50100.42± 2.272.25

88.06±0.16100.75

PH6.8PBS0.50.48±0.0496

55.11 土0.13102.298.88^3.123.16

2019.69 士 0.7898.45

PH6.5PBS0.50.52±0.03104.00

55.08 土 027 ’101.60102.22士 1.571.53

2020.21±1.16101.05

0.50.51±0.04102.00

PH7.4PBS54.98 土 0.1799.60100.17 土 1.631.63

2019.78 土 0.3698.90

AddedWithin-dayBetween-day

(Hg/ml)Detcted (ng/ml)RSD (%)Detcted (卩 g/ml)RSD(°/〇)

0.50.49±0.024.680.49 土 0.036.12

0.1MHCI22.08 士 0.02U61.96土 0.031.53

88_06土0.132.017.86 土 0.091.15

0.50.49±0.012.370.50 士 0.036.00

PH6.8PBS55.08 士 0.122,395.04±0.163.17

2020,59 士 0.492.3920.27土 0.673.31

0.50.50 土 0.024.000.50±0,024.00

pH6.5PBS54.98 士 0.204.064.96 土 0.112.22

2020.20土0.753.7320.19土 0.733.62

0.50.49 士 0.012.250 廉 0.024.00

pH7.4PBS54.91 士 0.163.164.97±0.142.82

2020.07士 0.552.7219.86 土 0.432.17

1.2.4檢測(cè)限

檢測(cè)限為25ng/ml。

1.3討論

相同濃度下IDM的紫外吸收靈敏度遠(yuǎn)低于5-RJ。一個(gè)劑量的IDM小丸 (25mg )在900ml釋放介質(zhì)中釋放10% (藥物濃度為2.7pg/ml)時(shí)的紫外吸 收值僅為0.04左右（X=320nm)。本文的重點(diǎn)是考察制劑的延遲釋藥時(shí)滯，采 用紫外分光光度法測(cè)定藥物的累計(jì)釋放量會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)較大誤差，因此 采用更為準(zhǔn)確的HPLC法作為體外分析方法.

2.載藥小丸的評(píng)價(jià)

本文采用IDM水混懸液法在Glatt流化床中對(duì)粒徑分布為710-85〇nm的 空白丸芯噴霧上藥，上藥效率達(dá)93.42%,粒徑范圍在18~24目的載藥小丸 占98.35°/。（圖2.1),小丸的栽藥量為27.27%。本文第二章與第四章的研究 均采用同一批載藥丸芯。

測(cè)定載藥小丸在不同介質(zhì)中的溶出度，結(jié)果見圖2.2。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)中羧 酸基團(tuán)的存在，IDM在不同介質(zhì)中的溶解度不同，隨著介質(zhì)pH值的增高， 溶解度增大。因此載藥小丸在各介質(zhì)中的溶出速度隨溶解度的增大而增大。 

IDM在pH7.4 PBS中，1 h完全溶出（pH7.4 PBS中IDM的溶解度約為 1.58mg/ml);在 pH6.5 PBS 和 pH6.8 PBS 中的溶出度近似(pH6.5 PBS 和 pH6.8 PBS中IDM的溶解度接近，約為0.54 mg/ml), 6 h藥物的溶出總量接近100%; 而在O.lmol/LHCl中6h藥物的溶出量不超過(guò)5%,此時(shí)載藥丸芯已經(jīng)完全破 碎，藥物粉末沉積在溶出杯底，這是由于在O.lmol/LHCl中藥物的溶解度極 小，小于 10fig/ml。

3.EudragitFS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的評(píng)價(jià)

3.1瓜爾膠包衣小丸的評(píng)價(jià)

3.1.1包衣增重及釋藥介質(zhì)pH對(duì)小丸釋放度的影響

由于IDM在介質(zhì)中的釋藥行為與其溶解度有關(guān)，且在O.lmol/LHCl中藥

物的溶解度極小，pH6.5 PBS和pH6.8 PBS中的溶解度近似。因此僅采用pH6.5 PBS和pH7.4 PBS 2種釋放介質(zhì)考察包衣增重對(duì)瓜爾肢包衣IDM小九釋藥行

為的影響。

從圖2.3和圖2.4可以看出兩種釋放介質(zhì)中瓜爾肢衣層均可在不同程度上 延緩藥物的釋放。包衣增重相同時(shí)IDM小丸在pH7.4 PBS中的釋放快于在 pH6.5 PBS中的釋放。表2.8分別歹|J出在2種釋放介質(zhì)中不同包衣增重小丸的 T10及T5G (藥物釋放10%和50%所需的時(shí)間）。隨著包衣層厚度的增加，T10 和T5G增大，在釋放較快的pH7.4PBS中，包衣增重為44%時(shí)即可實(shí)現(xiàn)T1()在 lh左右，這與第一章中以5-FU為模型藥，包衣增重達(dá)580%時(shí)的效果一致。 在各種瓜爾膠包衣增重下，與5-FU小丸相比，IDM小丸除了具有明顯長(zhǎng)的 釋藥時(shí)滯外，藥物的釋放速度也更慢。以包衣增重為580°/。的5-FU小丸和包 衣增重為499%的IDM小丸為例，5-FU小丸在不含酶的釋放介質(zhì)中2.5 h就 有50%的藥物釋出，而IDM小丸即使在釋放較快的pH7.4 PBS中，12h的釋 放總量也僅為45%左右。總之，瓜爾肢對(duì)難容性藥物的阻滯能力明顯強(qiáng)于對(duì) 水溶性藥物的阻滯。

024681012

Time (h)

—0% --e— 44% —93% —6— 184% -A— 311% -B— 499%

Fig.2.4 Release profiles of indomethacin from guar gum coated pellets in different coat weight gain in

pH7.4 phosphate buffer.

Tab2.8 Ti〇 and Ts〇 of guar gum coated pellets in different coat weight gain in pH6.5 and pH7.4

phosphate buffer.

Coat weight gain

44%93% 184%311%499%

T,〇(h)3.54.04.04.05.5

pH6.5

T5〇(h)8.513.816.319.0>20.0

T,〇(h)1.11.41.72.02.8

pH7.4 PBS

T5〇(h)4.04.76.09.8>12.0

Ti〇and Ts〇 were calculated by interpolating data of each individual release profile.

3.1.2瓜爾膠水解酶的影響

酶促型OCDDS的原理及優(yōu)勢(shì)在于結(jié)腸內(nèi)微菌群可特異性地降解相關(guān)材 料，而保證釋藥系統(tǒng)成功定位于結(jié)腸釋放僅是OCDDS的任務(wù)之一，隨后藥 物的釋放速度和程度則直接關(guān)系到病灶局部的藥物濃度是否維持在有效濃度 之上，將最終影響治療效果。因此分別考察了 5種增重的瓜爾肢包衣小丸在 含有半乳甘露糖苷酶釋放介質(zhì)中的釋藥行為（圖2.5)，篩選適宜的瓜爾膠內(nèi) 衣層厚度。由圖2.5可以看出，5種包衣增重的小丸在酶存在時(shí)10 h的累積 釋放量分別為100%、100%、78%、45%和36°/。，包衣層越厚，小丸的釋藥 速度越慢。Krishnaiah等[~研制的不同包衣增重的IDM瓜爾膠壓制包衣片在 4%的腸內(nèi)容物中10h的累積釋放量最大也僅有10%。采用壓制包衣技術(shù)制備 的可生物降解型OCDDS,包衣過(guò)程使用較大壓力，形成非常緊密的包衣層， 雖然可保護(hù)藥物安全通過(guò)胃和小腸，但是衣層的吸水溶脹速度過(guò)慢導(dǎo)致壓制

包衣片進(jìn)入結(jié)腸后酶不易進(jìn)入包衣層發(fā)揮降解作用。如果藥物的溶解度又較 低，釋藥速度就更加緩慢。本文所采用的流化包衣技術(shù)沒有引入外力，僅通 過(guò)瓜爾膠自身的粘性將瓜爾膠堆積于小丸表面，結(jié)構(gòu)較疏松，在水性環(huán)境中， 瓜爾膠衣層易被水化，因而小丸在進(jìn)入結(jié)腸后可以較快地發(fā)生酶降解作用。

(b)

⑷

鑒于瓜爾膠包衣增重為44%時(shí)，IDM小九在pH6.5 PBS和pH7.4PBS中 的T1()分別為3.5h和l.lh,可保護(hù)藥物在外衣層Eudragit FS30D溶解后不致 迅速釋出，將更多的IDM運(yùn)送至結(jié)腸發(fā)揮治療作用。較小的包衣增重使得小 丸進(jìn)入結(jié)腸后瓜爾肢衣層可被酶迅速降解，藥物以較快速度釋出，因此選擇 瓜爾膠內(nèi)衣層增重44%,

—184%-withgalactomannanase^ ......_

311%-with galactomannanase

—184%-without galactomannanase311%-withoiit galactomannanase

(C)

(d) 

 

20

(e)

Fig2.5 Release profiles of guar gum coated pellets of indomethacin with different coat weight gain: (a) 44%, (b) 93%, (c) 184%, (d) 311%, (e) 499% in the absence and presence of galactomannanase in

pH6.5 phosphate buffer.

3.2Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸的性狀及體外釋藥評(píng)價(jià)

分別對(duì)載藥丸芯進(jìn)行瓜爾膠和Eudragit FS30D雙重包衣，基于瓜爾膠包衣的口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)，包衣增重分別 為44%和30%。圖2.6為FS30D/瓜爾股雙重包衣小丸在電鏡下的剖面圖。從 圖中可以看到瓜爾膠衣層疏松、粗糙，而載藥層致密、均勻。這是由于上藥 前IDM經(jīng)微粉化后粒徑小于10pm,而瓜爾肢的粒後在300目左右„與第一 章中5-FU雙層包衣小丸相比，IDM小丸的內(nèi)衣層瓜爾股增重很小，電鏡下 觀察到IDM小丸內(nèi)、外衣層的厚度接近，整個(gè)小丸的粒徑很小僅為1.1 mm 左右„

圖2.7展現(xiàn)了在模擬胃腸道pH環(huán)境的梯度釋放介質(zhì)中載藥小丸、Eudragit FS30D包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜爾股雙重包衣小丸的釋藥曲線。作為難 溶性酸性藥物,IDM的溶解度與介質(zhì)的pH值有關(guān)。IDM在0.1 mol/L HC1中 的溶解度小于1 〇Hg/ml，因此在pH梯度釋放介質(zhì)中載藥丸芯最初2 h (0.1 mol/L HC1)的釋放總量小于4%,但在隨后2 h的pH 6.8 PBS中的釋藥量達(dá) 92.67%。對(duì)于Eudragit FS30D包衣小丸而言，F(xiàn)S30D衣膜保護(hù)藥物前4 h不 釋放，進(jìn)入pH7.4 PBS后衣膜迅速溶解，并在30 min內(nèi)釋藥76%左右，1 h 釋藥接近完全。而加入增重44%的瓜爾膠內(nèi)衣層后，雙層包衣小丸在進(jìn)入 PH7.4PBS后并不會(huì)迅速釋藥，在經(jīng)過(guò)約為0.5 h的時(shí)滯后藥物開始緩慢釋放， 此時(shí)總的釋藥時(shí)滯為4.5 h;當(dāng)雙層包衣小丸進(jìn)入模擬結(jié)腸的釋放介質(zhì)時(shí)（即 第5 h)，小丸的釋藥總量?jī)H為5.5%，實(shí)現(xiàn)了保護(hù)藥物至結(jié)腸的目的。此后 在瓜爾膠水解酶的作用下，瓜爾膠降解，藥物迅速釋出，lh的釋藥量達(dá)55% 

enteric coat (EudragitFS30D)

(guar gum)

and guar gum at a magnification of 150 folds.

左右；如無(wú)酶存在，瓜爾股繼續(xù)阻止藥物釋放，15 h后釋藥完全。因此對(duì)于 難溶性藥物而言，少的瓜爾膠衣層增重（44%)既可以有效延緩藥物釋放， 也可以迅速經(jīng)酶促發(fā)釋藥。

4.體內(nèi)分析方法的評(píng)價(jià) 4.1方法的專屬性

IDM的HPLC圖譜見圖2.8。由圖可知在建立的色譜條件下，IDM和萘 普生的保留時(shí)間分別為6.8min和4.7min，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)藥物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無(wú)

干擾。 

pellets.

4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

IDM血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為R=0.001382C-0.002352 (r=0.9999)，濃 度在50 ~ 6000ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.3血藥濃度分析方法的評(píng)價(jià) 4.3.1方法精密度

Tab2.9 Precision of the determination of indomethacin in dog's plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdetected (ng/nil)RSD (%)

5049.38土 0.941.90

Within-day500510.19 土 6.541.28

25002543.67±30,811.21

5049.52±2.154.34

Between-day500519.58 土 7.942.12

25002532.63±14.380.56

4.3.2方法回收率

Tab2.10 Accuracy of the determination of indomethacin in dog^s plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)C detected (ng/ml)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

504938±〇.9498.76

500510.19土 6.54102.04100.84土 1.811.79

25002543.67±30.81101.72

 

4.3.3提取回收率

Tab2.11 Extraction recovery of the determination of indomethacin in dog9s plasma (n=5).

C (ng/ml)Extraction recovery (%)Mean ± SDRSD (%)

5085.36

50082.0985.01 ±2.763.24

250087.57

1.3.4檢測(cè)限

檢測(cè)限為25ng/ml。

1.3.5定量限

最低定量限為50ng/ml。

5,Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣的IDM小丸犬體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究

5.1血藥濃度及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

犬口服IDM栽藥小丸、Eudragit FS30D包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜爾 膠雙重包衣小丸后不同時(shí)間的血藥濃度數(shù)據(jù)見表2.12、表2.13及表2.14,平 均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2.9,藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2.15。

Table2.12 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration ofuncoated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjectsX士 SD

12345

0000000

0.3331034.67241.89594.51747.61478.85619.51 士296.55

0.6672867.05587.70754.781896.711619.791545.21土924.39

15295.521619.791175.222863.024477.163086.14士1779.60

1.54135.643227.254500.864144.972783.643758.55土720.62

21663.004264.372855.211799.781741,852464.86士 1117.86

3880.421807.341540.22970.031001.841239.97土409.55

4323.81863.55645.88345.44422.10520.16±230.44

6180.47430.04358.70141.06195.41261.14土 125.79

8134.69164.35136.11111.14123.26133.91 士 19.77

10112.18119.11123.2858.9860.5794.83±32.25

1252.19049.760020.39±27.79

Table2.13 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration of Eudragit FS30D coated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjectsX士SD

12345

0000000

10048.49009.70士 21.67

23698.833676.26709.622975.29668.532345.59士 1540.28

31076.741451.713088.401050.792946.461922.34士 1013.51

4317.43664.72484.29484.63930.38576.98土232.63

5387.96357.88201.70200.32494.49328.64士 126.93

6300.25304.69139.45219.32448.93282.45士 114.32

7259.27333.19349.82248.39349.39308.77土 50.05

8168.21586.78102.40154.16281.27258.41±194.52

10408.00554.18713.42529.00512.94542.92土 110.04

12637.54498.29560.03560.37410.50533.28士 84.56

24104.17165.72251.42261.57204.31197.36土 64.67

30097.2452.9742.1652.6449.16±34.64

Table2.14 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration of Eudragit FS30D/GG double coated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

0000000

1000000

2000000

358.98247.3450.41276.29240.42174.69±110.41

4131.90533.2798.881454.21650,34573.72土 548.51

5404.781073.171421.831381.331515.591159.34土453.28

6688.601163.92929.19889.961001.84934.70士 172.95

7694.40825.82702.89562.09422.10641.46士 154.10

8445.07492.79318.05286.94303.38369.25土 93.20

10431.61390.89440.20495.02213.72394.29土 107.54

12372.18379.58414.54466.78245.02375.62士 82.02

24268.1880.26228.6850.0682.95142.03土 98,98

30053.8061.84056.3234.39士 31.53

Tab2.15. Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of indomethacin in beagle dogs (n=5) after oral administration of (dose 25mg) of IDM formulations.

ParametersUncoated pelletsFS30D coated pelletsFS30D/GG coated pellets

AUC〇.〇〇(ng/mIh)8779.40土 1133.9413074.11土709.308852.81 士990.12 #

C,™x (ng/ml)4665.27±541.383296.87土390.721295.51±354.50*#

T陳(h)1.48 士 0.392A6±0A95.41±0.77*#

T.ag(h)0.26±0.070.99 士 0二02.84 土 0.41

MRT(h)2.56 土 0.6710.60 土 2.0111.68±1.67*

* vs uncoated pellets, at P<0.01; # vs FS30D coated pellets, at P<0.01

-uncoated pellet s -FS30D coated pellets -FS30D/GG pellets

EudragitFS30D包衣小丸在體外釋放度試驗(yàn)中第4h開始釋藥，而犬口服 后最早在第lh即在血中檢測(cè)到藥物，Tlag僅為0,99h，這與第一章中5-FU的 Eudragit FS30D包衣小丸的體內(nèi)行為一致，最早于給藥后的2 h從血中檢出 5-FU。表明小丸口服后l-2h即被轉(zhuǎn)運(yùn)到pH值>7的腸段。Eudragit FS30D/ 瓜爾膠雙層包衣小丸于給藥后3h在血中檢出藥物，Tlag為2.84h，短于體外試 驗(yàn)中4.5h的釋藥時(shí)滯。雙層包衣小丸口服后很快即被轉(zhuǎn)運(yùn)到pH值>7的腸液 中，Eudragit FS30D衣膜溶解，瓜爾膠暴露于腸液中，由于瓜爾膠層的增重 僅為44%,并且小丸在FS30D溶解后和進(jìn)入結(jié)腸前一直處于pH值較高的環(huán) 境，這可能是引起體內(nèi)釋藥時(shí)滯縮短的主要原因。當(dāng)然也有可能因?yàn)槿改c 道的生理學(xué)特點(diǎn)與人不盡相同，固體制劑在其中的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間與人體有異。

表2.16以F值CP=AUC〇_t/AUCVooX 1 〇〇%)間接揭示了 3種小丸在犬體內(nèi) 不同時(shí)間的釋藥程度。對(duì)于載藥丸芯，3h的蘆值即達(dá)72.39% ; Eudragit FS30D 包衣小丸的F值在3h為25.37%, 5h達(dá)38.89%;而Eudragit FS30D/瓜爾肢雙 層包衣小丸的F值在4h僅為5.39%, 5h為15.81%。這表明口服3種小丸后 載藥丸芯可迅速釋出藥物；Eudragit FS30D衣層雖可在一定程度上延遲藥物

的釋放，但到達(dá)結(jié)腸前藥物的釋出過(guò)多（約40%左右）無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效的結(jié)腸 定位釋藥；而Eudragit FS30D/瓜爾膠雙衣層可有效避免藥物在上消化道的釋 放，將更多的藥物（約85% )濃集于結(jié)腸釋出，可發(fā)揮更好的治療作用。

對(duì)于AUC而言，Eudragit FS30D包衣小丸最大，Eudragit FS30D/瓜爾 膠雙層包衣小丸與載藥丸芯無(wú)顯著性差異（p>0.01)。這與吲味美辛為脂溶性 藥物，在整個(gè)腸段均有較好的吸收有關(guān)。

Tab2.16. The fraction of AUC〇.t under different time against AUC〇-〇〇.

FormulationTime interval

0?3h0?4h0?5h

Uncoated pelletsAUC〇.t(ng/ml-h)

AUCo^ng/mlh)6355.417235.47

8779.408016.76

F72.39%82.41 %91.31 %

FS30D coated pelletsAUC〇.t(ng/ml-h)

AUC〇-〇〇(iig/ml.h)3316.794566.24

13074.115018.65

F25.37 %34.93 %38.89%

FS30D/GG coated pelletsAUC〇.t(ng/ml*h)

AUC〇-〇〇(ng/ml_h)103.04477.24

8852.811343.77

F1.16%5.39 %15.81%

F= (AUC〇V AUC〇^) xl〇〇%

5.2討論

體內(nèi)驗(yàn)證藥物的結(jié)腸靶向性一直是口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)研究的關(guān)鍵和 難點(diǎn)。本文選用犬做為動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)以Eudrgit FS30D為包衣材料的pH敏 感型OCDDS，不論是以5-FU還是以IDM為模型藥，在體內(nèi)的釋藥時(shí)滯均 小于體外。這可能與以下兩種原因有關(guān)：1、小丸在犬胃和小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間小 于5h。2、犬小腸中部的pH值即在7以上。第一種可能性已被其他研究者所 驗(yàn)證。以對(duì)乙酰氨基酚為模型藥的CODES™在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)表明藥物延 遲吸收時(shí)滯為3h，而體外釋藥時(shí)滯為5h，而對(duì)照制劑（普通腸溶衣）0.5h即 入血吸收，表明犬的胃排空時(shí)間不到半小時(shí)[6-7]。分別以甘草皂甙和柳氮靖此 啶為模型藥的結(jié)腸靶向制劑PCDCS犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)表明藥物的延遲吸收 時(shí)間分別為3.3h和3.5h小于體外5h的釋藥時(shí)滯[8-9]。另外1993年Davis等人 的研究表明犬小腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間僅有2h左右[1Q]。

本章制備的吲咮美辛Eudrgit FS30D/瓜爾膠雙層包衣小丸的粒徑僅在 1.1mm左右，因此以后的工作中可以選用大鼠為動(dòng)物模型，考察不同動(dòng)物的 轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間對(duì)體內(nèi)釋藥時(shí)滯的影響，并可以進(jìn)行不同時(shí)間藥物在胃腸道分布的 試驗(yàn)，更加直觀地了解藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。

另外為了延長(zhǎng)體內(nèi)的釋藥時(shí)滯，可以適當(dāng)增加內(nèi)衣層瓜爾膠的厚度，降 低達(dá)到結(jié)腸前藥物的前釋，更好的實(shí)現(xiàn)藥物的結(jié)腸靶向轉(zhuǎn)運(yùn)。

4.小結(jié)

本章以吲哚美辛為模型藥進(jìn)行了 pH-酶雙重促發(fā)的結(jié)腸定位釋藥小丸的 研究，體外釋放度試驗(yàn)表明瓜爾膠內(nèi)衣層的厚度在44%即可形成有效時(shí)滯， 與5-FU同種小丸相比，瓜爾肢層的厚度降低了 92%左右。體內(nèi)試驗(yàn)表明， 與栽藥小丸相比，EudrgitFS30D/瓜爾膠雙重包衣的吲哚美辛小丸可以顯著延 長(zhǎng)藥物的Tmax、Tlag和MRT，并降低Cmax，實(shí)現(xiàn)了結(jié)腸靶向釋藥的目的。

結(jié)合第一章的試驗(yàn)結(jié)果可知Eudrgit FS30D/瓜爾膠雙重包衣可以通過(guò) pH-酶雙重釋藥機(jī)制保護(hù)難容性藥物IDM和水溶性藥物5-FU通過(guò)上消化道， 將大多數(shù)藥物運(yùn)送至結(jié)腸后釋放。兩種溶解性能的藥物實(shí)現(xiàn)同樣的釋藥時(shí)滯 僅通過(guò)改變內(nèi)衣層瓜爾膠的厚度，并且不同厚度的瓜爾膠層在結(jié)腸微菌群的 作用下均能迅速釋藥，使藥物富集于結(jié)腸局部，發(fā)揮更好的治療作用。

單純的pH敏感型結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)雖然制備簡(jiǎn)單，但由于人胃腸道的 生理特點(diǎn)，藥物到達(dá)結(jié)腸前即會(huì)大量釋出，這會(huì)造成藥物的全身吸收增加、 結(jié)腸病變部位藥物濃度不足，導(dǎo)致治療的失敗。本文以EudragitFS30D/瓜爾 膠雙重包衣技術(shù)制備的結(jié)腸定位釋藥小丸采用pH敏感-酶促發(fā)兩種機(jī)制共同 控制藥物的釋放，使藥物可以更安全、有效地靶向于結(jié)腸釋放。

瓜爾膠的水凝膠性質(zhì)可以在一定的程度上阻礙藥物的釋放但阻滯能力有 限。本部分將惰性包衣材料乙基纖維素（ethylcellulose，EC)引入瓜爾膠層， 利用它的疏水性，延長(zhǎng)釋藥時(shí)滯，同時(shí)瓜爾股依然通過(guò)酶促機(jī)制釋藥?？刂?瓜爾膠和乙基纖維素的比例及包衣厚度實(shí)現(xiàn)延遲釋藥5 h。

時(shí)間依賴-酶促發(fā)雙重控制結(jié)腸定位釋藥小丸的設(shè)計(jì)原理為：瓜爾膠為水 溶性高分子材料，乙基纖維素為疏水性高分子材料，將二者混合后作為包衣 材料對(duì)載藥小丸進(jìn)行單層包衣。其中瓜爾膠扮演著衣層中的親水通道，乙基 纖維素則為疏水阻滯屏障。當(dāng)小丸進(jìn)入水性環(huán)境后，包衣層中的瓜爾膠逐漸 被潤(rùn)濕，形成親水凝膠通道，釋放介質(zhì)經(jīng)此通道向丸芯慢慢滲入，一定時(shí)滯 后（5h左右），載藥丸芯被潤(rùn)濕，藥物沿親水通道釋出，即小九口服后約經(jīng)5 h到達(dá)回盲部開始釋藥。當(dāng)小丸進(jìn)入結(jié)腸后，在菌群的酶解作用下，瓜爾膠 被水解，藥物自九芯釋出的屏障減少，釋藥速度加快。 

第三幸5-氟尿嘧啶時(shí)間依賴-酶促發(fā)雙重控制小丸

一.材料與儀器

1.材料

5-氟尿嘧啶載藥丸芯本文第一章制備

瓜爾肢（5200 ~ 5500cps )法國(guó)Rhodia公司

乙基纖維素水分散體（Surelease®E-7-19010)英國(guó)Colorcon公司

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg) 5-溴尿嘧啶（5-BU,內(nèi)標(biāo)）Fluka Biochemika Sigma公司

曱醇（色譜純）Merck公司

用于HPLC的試劑為色譜純，鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等其他試劑均為

分析純 2.儀器

JGM-H50氣流粉碎機(jī) UV-2401PC型紫外分光光度計(jì) BS210S電子天平 BS610S電子天平 85-2型恒溫磁力攪拌器 微型流化包衣設(shè)備 益森牌離心式單相又流鼓風(fēng)機(jī) DDB-320多功能電子蠕動(dòng)泵 ZRS-8G智能溶出儀 S-520掃描電子顯微鏡華東理工大學(xué) 曰本島津 Sartorius Sartorius

上海智威電器有限公司 自制

浙江溫嶺市潘郎鼓風(fēng)機(jī)廠 寧波石浦海天電子儀器廠 天津大學(xué)無(wú)線電廠 曰本Hitachi公司

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀美國(guó)安杰倫公司

(G1322ADEGASSER, G1311A QuatPump, G1313A ALS, G1315B DAD) XW-80型旋渦混合器上海超聲波儀器廠

3.動(dòng)物

Beagle 犬，3，8.0±2.0kg,普通級(jí)上海市新岡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)

.實(shí)驗(yàn)方法

1.體外分析方法的建立（與第一章相同）

2.1瓜爾肢-乙基纖維素混合包衣液的配制

稱取適量瓜爾肢，用乙醇分散，攪拌下加入蒸餾水，形成4% (W/V)瓜 爾膠在醇/水（1/4, V/V)體系中的混懸液。然后加入一定量的Surelease,挽 拌均勻后即得瓜爾膠和乙基纖維素的混合包衣液。

2.2小丸包衣

載藥小丸10g加到自制微型流化床中，噴嘴直徑為0.8mm，控制出口溫 度為33±2°C,噴液速率為l.Oml/min,在固定的風(fēng)量和霧化壓力下進(jìn)行噴液 包衣，直至達(dá)到預(yù)設(shè)的包衣增重。包衣過(guò)程中需要連續(xù)挽拌包衣液。小丸包 衣完成后，將小丸置于60°C的烘箱中干燥6h。

2.3釋放度試驗(yàn)

按轉(zhuǎn)籃法測(cè)定，余下操作同第一章實(shí)驗(yàn)方法中3.1.3項(xiàng)下所述。除非另有 說(shuō)明外，釋放介質(zhì)均為PH6..5PBS，在pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶 (0.00968U/ml)來(lái)模擬在體結(jié)腸的酶解環(huán)境。

2.4影響釋藥的因素 2.4.1釋藥介質(zhì)pH的影響

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS4 種釋放介質(zhì)對(duì)

瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸釋放度的影響。

2.4.2瓜爾股-乙基纖維素比例及包衣增重的影響

瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸的釋藥行為受包衣處方中瓜爾膠與乙基纖 維素比例和包衣增重影響，以瓜爾肢與乙基纖維素的比例（A)和包衣增重 (B )為因素，以T5和丁9〇 (藥物釋放5%和90%所需要的時(shí)間）為效應(yīng)，進(jìn) 行析因設(shè)計(jì)/效應(yīng)面優(yōu)化，篩選較優(yōu)處方。因素水平及析因?qū)嶒?yàn)安排見表3.1。

Tab.3.1 Factors and levels table of 3X4 factorial design for optimizing preparation method of

GG-EC mixed coated pellets.

AGG:ECB Coat weight gain

B! 100%B2 200%B3 300%B4 400%

Ai1/1A,B,Ai B2A,B3Ai B4

A21/2A2B,A2 B2A2 BJA2B4

A31/4A3B,A3B2A3 B3A3 B4

在pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.00%8U/ml)來(lái)模擬在體結(jié)腸的 酶環(huán)境，考察較優(yōu)包衣處方小丸在其中的釋藥行為。

3.掃描電镋觀察

分別在掃描電鏡下觀察瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸、瓜爾膠包衣小丸和 乙基纖維素包衣小丸的表面形態(tài)及在釋放度試驗(yàn)中瓜爾膠-乙基纖維素包衣 小丸的表面形態(tài)。

4.體內(nèi)分析方法的建立（同第一章）

5.瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸在犬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究

5.1研究對(duì)象

Beagle 犬 5 只，8.0±2.0kg,普通級(jí)

5.2試驗(yàn)制劑與參比制劑

受試制劑：GG-EC包衣小丸，GG:EC=1:2,包衣增重405%。

參比制劑：載藥小丸 5.3試驗(yàn)設(shè)計(jì) 服藥方法：

采用自身對(duì)照交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，洗凈期為1周。5只犬，禁食過(guò)夜（18h), 次曰清晨空腹給藥(含5-FU50mg),用10ml水灌胃《由于本章的瓜爾膠-乙基 纖維素包衣小丸和本文第一章中的Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸的犬 體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)研究均以5-FU載藥小丸為參比制劑，因此兩部分藥物動(dòng)力學(xué) 試驗(yàn)一起完成。服藥方案見第一章表1.1 (p23)。

血樣采集：

于服藥前后設(shè)定的時(shí)間從前肢靜脈取血1.2ml,置于肝素鈉離心管中， 8000rpm離心lOmin ,取上清血槳于-20°C冷凍保存，待分析。

服用栽藥小丸的取樣時(shí)間點(diǎn)：5min、15min、30min、45min、lh、1.5h、 2h、 3h、 4h、 5h、 7h、 9h„

服用瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸的取樣時(shí)間點(diǎn)：lh、2h、3h、4h、5h、 6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h

樣品分析方法：用本文第一章建立的HPLC法測(cè)定血漿中的5-FU濃度。 5.4數(shù)據(jù)處理

直接讀取*Tmax，并用t檢驗(yàn)法對(duì)兩參數(shù)進(jìn)行方差分析（其中Cmax 經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換）。

3.結(jié)果與討論

1•體內(nèi)、外分析方法的評(píng)價(jià)（同第一章）

2.1包衣液處方的選擇及配制和包衣小丸的制備

在瓜爾膠衣層中引入水不溶性包衣材料，來(lái)延長(zhǎng)小丸的釋藥時(shí)滯至5h左 右?；诠蠣柲z包衣的口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)，常用的水不溶性包衣材料有醋酸纖維素、乙基纖維素和滲透型丙稀酸樹 脂（EudragitRL、EudragitRS、EudragitNE) [1]。乙基纖維素形成的衣膜在 水中的通透性最小，因此本文以它作為混合衣層中的疏水性高分子材料。

瓜爾肢和乙基纖維素的溶解性質(zhì)相反：乙基纖維素不溶入水，溶于乙醇、 丙酮、異丙醇等多數(shù)有機(jī)溶劑，而瓜爾膠僅在水中溶解，不溶于任何有機(jī)溶 劑。若采取有機(jī)溶劑包衣，瓜爾肢完全呈分散狀態(tài)，包衣過(guò)程中易與乙基纖 維素的有機(jī)溶液分離，干燥后成粉而導(dǎo)致包衣效率低，且會(huì)引起衣層中瓜爾 膠和乙基纖維素的比例發(fā)生改變。為此采用水性包衣工藝，將乙基纖維素的 水分散體Surelease和瓜爾膠水/醇體系的混懸液直接混合（見第一章），攪拌 均勻后即可用于小丸的包衣。

Surelease的最低成膜溫度（MFT)為23°C,理想的包衣溫度為34-38°C[2]， 因此混合包衣的操作溫度控制在出口溫度為33±2°C，高于瓜爾膠單獨(dú)包衣的 操作溫度。

2.2釋藥影響因素 2.2.1.釋藥介質(zhì)pH的影響

瓜爾股-乙基纖維素混合包衣小丸（GG:EC=1:2，包衣增重為419%)在 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 中的釋放曲線如圖 3.1。4 條曲線兩兩間的f2均大于80，表明包衣小丸的釋藥速率不受釋放介質(zhì)pH值 的影響。5-FU在4種介質(zhì)中的溶解度近似（約為18mg/ml),包衣材料瓜爾 膠和乙基纖維素對(duì)pH無(wú)選擇性，因此5-FU從瓜爾肢-乙基纖維素包衣小丸 中的釋放程度和速度僅和包衣處方中乙基纖維素的比例和衣層的厚度有關(guān)。 為簡(jiǎn)便起見，本章中的釋放度試驗(yàn)均選用PH6.5PBS作為釋放介質(zhì)。

2.2.2瓜爾膠和乙基纖維素的比例及包衣增重對(duì)小丸釋放度的影響

根據(jù)析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)制備的包衣小丸的釋藥曲線分別見圖3.2、3.3和3.4。 從圖中可以看出，12種處方的小丸均具不同長(zhǎng)短的釋藥時(shí)滯，并且藥物延遲 釋放的時(shí)間隨著乙基纖維素在衣層中所占比例的增大及衣層厚度的增加而增

加。

表3.2為析因設(shè)計(jì)-效應(yīng)值表。以Statistica 6.0為統(tǒng)計(jì)軟件，分別按多元 線性方程yH^o+b^x丨+b2x2和多元非線性方程y^bo+b^+b^ +b3x12+b4x22+ b5x :Jx2擬合。

Time (h)

Fig3.1.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:2, CWG419%) in O.lmol/L HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 phosphate buffer

Fig3.2.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:1) with different coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Time (h)

Fig3.3.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:2) with ditferent coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Time (h)

Fig3.4.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:4) with different coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Tab. 3.2 Experimental design table (columns 1-3) with experimentally determined values of different dependent variables (columns 4-5)

Formulation

No.GG:EC

XiCoat weight gain

x2T5

(h)丁90

(li)

11/1111%0.62.0

21/1208%1.12.6

31/1314%1.73.4

41/1438%2.35.2

51/2100%2.05.2

61/2200%3.46.7

71/2313%4,51.1

81/2419%5,59.8

91/4100%3.08.5

101/4198%4.010.1

111/4318%6.013.9

121/4401%8.116.0

T5 and T90 were calculated by interpolating data of each individual release profile.

各效應(yīng)對(duì)兩因素各水平的回歸方程分別如下：

多元線性:

T5 : y= (3.868286) + (-5.24388)* Xj + (1.025249)*x2(r=0.9544669)

T9〇 : y= (10.13396) + (-11.5362)* x, + (1.610443)*x2(產(chǎn)0.9579517)

多元非線性：

T5 :y= (2.436130) + (-4.48829)=^ + (1.828711)*x2+ (2.325300)* x!2

+ (0.009615)* x22+ (-1.42958)* x !x2(r=0.9890579)

T9〇:y= (12,681484) + (-25.508375)*x1 + (1.8738723)*x2 + (15.01217)*X!2

+ (0.1824542)*X22+ (-2.0470277)*X!X2(r=0.9950415)

其中，y代表T5和T9〇，x!*x2代表瓜爾膠-乙基纖維素的比例和包衣增 重兩因素。二項(xiàng)式擬合效果更為理想。對(duì)二項(xiàng)式中的6個(gè)系數(shù)進(jìn)行方差分析 (ANOVA)通過(guò)t檢驗(yàn)在p<0.2水平上拒絕某些系數(shù)，簡(jiǎn)化方程。效應(yīng)T5 和T9Q簡(jiǎn)化前后的各系數(shù)值表分別見表3.3、3.4、3.5和3.6

Tab.3.3 Parameters of Ts valued by nonlinear binomial.

bOblb2b3*b4*b5

Estimate2.436130-4.488291.8287112.3253000.009615-1.42958

Std.Err.L0751712.938030.6035922.1740450.1153600.34800

t(6)2.265808-1.527653,0297151.0695730.083348-4.10800

p-level0.0640350.177460.0231060.3259400.9362860.00630

r=0.98906;* p<0.2 rejecting the hypothesis

Tab.3.4 Parameters of T5 after simplified.

bOblb2b5

Estimate1.680228-1.539661.869726-1.41320

Std.Err.0.6097260.922210.2159970.32033

t(8)2.755713•1.669538.656245-4.41175

p-level0.0248390.133560.0000250.00225

r-0.98695

Tab.3.5 Parameters of T90 valued by nonlinear binomial.

bOblb2b3b4*b5

Estimate12.68148-25.50841.87387215.012170.182454•2.04703

Std.Err.1.447783.95620.8127702.927480.1553390.46860

t(6)8.75926-6.44762.3055395.128011.174557-4.36839

p-level0.000120.00070.0606380.002160.2846730.00473

r=0.99504;* p<0.2 rejecting the hypothesis

Tab.3.6 Parameters of T90 after simplified.

bOblb2b3b5

Estimate11.81977-25.6591 2,75740614.90504-1.92296

Std.Err.1.281524.0600 0.3160473.004350.46875

t(7)9.22322-6.3200 8.7246604.96115•4.10227

p-level0.000040.0004 0.0000520.001640.00456

r=0.99390

因此簡(jiǎn)化的方程分別為

T5 : y = (1.680228)+ (-1.53966)*XI + (1.869726)*X2+(-1.41320)* X!X2 T9〇: y = (11.81977) + (-25.6591)^! + (2.757406)*x2+ (14.90504)*Xl2 + (-1.92296)*X1X2

根據(jù)簡(jiǎn)化后的二項(xiàng)式擬合描繪各效應(yīng)對(duì)兩因素的效應(yīng)面，見圖3.5和圖 3.6。由圖可知幾和！^隨EC比例的增加和包衣增重的增大而增大，要實(shí)現(xiàn) 安全轉(zhuǎn)運(yùn)藥物至結(jié)腸的目的，基于瓜爾膠包衣的口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)，應(yīng)滿足T產(chǎn)5h。為了考察瓜爾膠-乙基纖維素混 合衣層對(duì)結(jié)腸內(nèi)瓜爾膠水解酶的敏感性，應(yīng)用Statistic6.0描繪各效應(yīng)面的等 高線，將各等高線重合（圖3.7)，在丁5>511區(qū)域內(nèi)(圖3.7中黑線左上方區(qū)域) 確定不同T9〇的3個(gè)處方：GG: EC為1:2，包衣增重400%、GG: EC為1:4, 包衣增重300%和GG: EC 1:4，包衣增重400%進(jìn)行下一步研究。 

Fig3.6 The predicted response surface of T90 as a function of the percentage of the radio of GG/EC

and coat weight gain.

Fig3.7 Overlapping figure of the contour plots of Fig3.3?3.6.

按優(yōu)選處方制備包衣小丸，進(jìn)行釋放度考察，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)杲進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié) 果見表3.7。由表3.7可知3種處方的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值的偏差均小于10%,因 此采用析因設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法篩選處方具有較好的預(yù)測(cè)效果。

IndexObserved valuesPredicted valuesDeviation

T55.105.62-9.25%

GG:EC=1:2,405%

T909.76-2.30%

T55.755.89-2.38%

GG:EC=1:4, 303%

丁9012.00-9.29%

T57.807.474.42%

GG:EC=1:4, 407%

T9016.2515.604.00%

2.2.3半乳甘露糖苷酶對(duì)瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸釋放度的影響

首先考察GG:EC ( 1:2 )，包衣增重405%、GG:EC (1:4 )，包衣增重303% 和GG:EC (1:4 )，包衣增重407% 3種處方的小九經(jīng)過(guò)胃和小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入結(jié) 腸后經(jīng)酶促釋藥的速度。由于瓜爾膠-乙基纖維混合包衣小丸的釋放度與介質(zhì) 的pH值無(wú)關(guān)，方便起見，以pH6.5PBS5h作為結(jié)腸前的釋放介質(zhì)。5h后在 PH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.00%8U/ml)來(lái)模擬在體結(jié)腸的酶環(huán)境。

3種包衣處方小丸的釋放度結(jié)果見圖3.8、圖3.9和圖3.10。從圖中可看 出每種包衣小丸在含酶的釋放介廣中的釋藥速度均有一定程度的加快。由于 包衣層中引入乙基纖維素，瓜爾肢含量降低，因此瓜爾膠-乙基纖維素的混合 衣層對(duì)酶的敏感度降低。與本文第一章中包衣增重為580%的瓜爾膠包衣小 丸相比，包衣增重405%的GG-EC( 1:2)混合包衣小丸、包衣增重303%的 00祝（1:4)混合包衣小丸和包衣增重407%的0。疋(：（1:4)混合包衣小 丸進(jìn)入模擬結(jié)腸的釋放環(huán)境lh后的釋藥量分別為13.68°/。、7.71%和1 %,遠(yuǎn) 低于瓜爾膠包衣小丸65 %的釋藥量。

圖3.10顯示，與增重303%的GG-EC( 1:4)包衣小丸和增重405%的GG-EC (1:2)包衣小丸相比，增重407%的GG-EC( 1:4)包衣小丸的釋藥時(shí)滯約為 7h左右。最初的設(shè)想是希望包衣小丸有足夠長(zhǎng)的釋藥時(shí)滯（>5h)，但在進(jìn)入 含酶的環(huán)境中能夠很快開始釋藥，即大于5h的時(shí)滯可以避免由于胃和小腸轉(zhuǎn) 運(yùn)時(shí)間的變異引起的藥物提早釋放，而衣層中瓜爾膠對(duì)酶的敏感性可以使過(guò) 長(zhǎng)的釋藥時(shí)滯在進(jìn)入結(jié)腸后失效，藥物經(jīng)酶促發(fā)機(jī)制開始釋放并且以更快的 速度釋出。然而圖3.10的結(jié)果表明這種設(shè)想未能實(shí)現(xiàn)。小丸在經(jīng)過(guò)前5h(胃、 小腸轉(zhuǎn)運(yùn)）的釋放后進(jìn)入含瓜爾膠水解酶的人工結(jié)腸液，酶的存在并未終止 過(guò)長(zhǎng)的釋藥時(shí)滯，酶促發(fā)藥物釋放直到8h之后才開始。

圖 3.8 (GG:EC = 1:2，包衣增重 405%)和圖 3.9 (GG:EC = 1:4,包衣增

o o

6 4

P3S«3I<U.I luuaidOM

20

重303%)表明，兩種小丸均有5 h左右的釋藥時(shí)滯，進(jìn)入含酶的釋放介質(zhì)后， 瓜爾膠水解，藥物的釋出加快。盡管2種小丸的釋藥時(shí)滯相當(dāng)，但由于瓜爾 膠和乙基纖維素的比例不同，二者在時(shí)滯之后的釋藥速度不同。GG:EC為1:2 的包衣小丸的衣層增重（405 % )顯著大于GG:EC為1:4的包衣小丸（303% )， 但進(jìn)入瓜爾膠水解酶的環(huán)境中的釋藥速度更快，5 h內(nèi)釋放完全，而后者需要 11 h才能釋放完全。因此選擇GG: EC為1:2,包衣增重為405%的小丸作為 最優(yōu)處方進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。

024681012

Time (h)

Fig.3.9.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG: EC=1:4) in pH6.5

phosphate buffer. 

80 1

60

40

20

 

2.3討論 2.3.1瓜爾膠-乙基纖維素混合衣層阻滯藥物釋放的效果

瓜爾膠對(duì)藥物有一定的阻滯作用，但單獨(dú)使用無(wú)法滿足OCDDS 5h的釋 藥時(shí)滯。將水不溶性包衣材料乙基纖維素引入瓜爾膠衣層后，混合衣層阻滯 藥物釋放的能力明顯增強(qiáng)。當(dāng)乙基纖維素達(dá)到一定的比例，混合衣層可以延 遲5h釋放藥物，實(shí)現(xiàn)靶向于結(jié)腸釋藥的目的。圖3.11將包衣增重接近的瓜 爾膠包衣小丸（第一章）和不同比例的瓜爾肢-乙基纖維素混合包衣小丸（本 章）在pH6.5PBS中的釋放曲線集中起來(lái)，更為直觀地展現(xiàn)了乙基纖維素對(duì) 藥物的阻滯作用。

Fig,3.11 .Release profiles of 5-fluorouracil from GG coated and GG-EC mixed coated pellets with different ratio of GG against EC in pH6.5 phosphate buffer. 

2.3,2瓜爾膠-乙基纖維素混合衣層的性質(zhì)

大多數(shù)水分散體需要通過(guò)包衣后的熱處理工藝來(lái)促成衣膜的完全愈合， 但對(duì)于乙基纖維素的水分散體Surelease來(lái)說(shuō)，衣膜的愈合可以在包衣過(guò)程中 完成[31。由于混合包衣液中的瓜爾膠為混懸液，粒徑在300目左右，無(wú)法在 包衣過(guò)程及通過(guò)熱處理工藝來(lái)促成完整、連續(xù)衣膜的形成，因此瓜爾膠和乙 基纖維素混合衣層不是連續(xù)的衣膜。分別在掃描電鏡下觀察瓜爾膠包衣小丸、 瓜爾膠-乙基纖維素混合包衣小丸和乙基纖維素包衣小丸的表面形態(tài)，結(jié)果如 圖3.12所示。由于引入了乙基纖維素，混合衣層的連續(xù)性要優(yōu)于瓜爾膠衣層, 但明顯不如乙基纖維素衣膜。

2_3.3包衣小丸釋藥機(jī)制

圖3.13展示了釋放度試驗(yàn)進(jìn)行至第4h時(shí)瓜爾膠-乙基纖維素混合包衣小 丸的形態(tài)，可以看出乙基纖維素形成難溶性的骨架，瓜爾肢形成親水通道， 藥物通過(guò)此通道釋出。瓜爾膠在衣層中的比例決定著親水通道的多少，包衣 層的厚度決定著釋放介質(zhì)到達(dá)栽藥丸芯所要克服的路徑，這兩者共同決定了 最終的釋藥時(shí)滯時(shí)間3另外瓜爾膠在衣層中所占的比例也決定著時(shí)滯后藥物 的釋藥行為。瓜爾膠比例越高，衣層的酶敏感性越強(qiáng)，進(jìn)入結(jié)腸后經(jīng)酶促發(fā) 的藥物釋放更迅速。

由于混合包衣材料中的瓜爾膠除了具備高度的親水性外，還可以被結(jié)腸 內(nèi)微菌群產(chǎn)生的酶特異性降解，因此存在于釋放環(huán)境中的酶可以成為促使藥 物開始釋放的誘因。但是這一誘因能否成功促發(fā)藥物釋放還依賴于釋藥系統(tǒng) 對(duì)水的通透性。系統(tǒng)對(duì)水的通透性高，酶才可以逐漸深入釋藥系統(tǒng)水解瓜爾 膠，釋出藥物。這與文獻(xiàn)報(bào)道的生物可降解型OCDDS所采用材料的親水性 的好壞決定著菌群能否有效地對(duì)其進(jìn)行消化，引起/加快藥物釋放的結(jié)論一致 [4_7]。本研究的初衷是控制釋藥時(shí)滯大于5h,進(jìn)入結(jié)腸后經(jīng)菌群促發(fā)而釋藥， 這樣可以避免胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間變異引起的結(jié)腸定位釋藥不準(zhǔn)確。但研究結(jié)果 (圖3.10)表明酶進(jìn)入釋藥系統(tǒng)水解瓜爾膠引發(fā)藥物釋放的時(shí)間與自身的釋 藥時(shí)滯一致。這表明包衣層中的瓜爾膠被水潤(rùn)濕形成親水通道延伸至栽藥丸 芯時(shí)藥物開始釋出，瓜爾肢水解酶隨著親水通道的形成進(jìn)入給藥系統(tǒng)，伴隨 藥物釋出的開始發(fā)揮酶解作用，在釋藥時(shí)滯后加速了藥物的釋放。

3.瓜爾肢-乙基纖維素混合包衣的5-FU小丸犬體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)

犬口服5-FU載藥小丸、瓜爾膠-乙基纖維素混合包衣小丸的血藥濃度數(shù) 據(jù)分別見表3.8和表3.9,平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖見圖3.14,藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見 表 3.10。

Tab3.8 plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of uncoated pellets (n=5)

TimeNo. of subjectsX 土 SD

(h)12345

0000000

0.0833044.40028.2129.5220.43士 19.70

0.25138.22160.6229.64152.23122.43160.63土 41.21

0.5319.50366.6317.93318.96336.99331 別土 20.64

0.7590.2385.8255.6885.02130.1889.39土 26.61

128.7323.85021.3666.7728.13 土24.21

1.5000025.615.55 士 11.21

2000000

2.5000000

3000000

4000000

5000000

7000000

9000000

Tab3.9 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of GG-ECcoated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

000000

100000

200000

300000

400000

5030.43000

633.220063.720

70084.36051.36

800000

1000000

1200000

2400000

Tab3.10 Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of 5-fluorouracil in beagle dogs (n=5) after oraladministration of (dose 50 mg) of 5-FU formulations.

parametersUncoated pelletsGG-EC mixed coated pellets

Cmax (ng/ml)332.00±20.8952.62土 20.01 *

Tmax (h)0.50±0.006.20±0.75 *

vs uncoated pellets, at P<0.01

從結(jié)果可以看出2種小九體內(nèi)行為有著顯著的差異。與載藥丸芯相比， 瓜爾膠-乙基纖維素混合包衣小丸的丁^為6.2h明顯長(zhǎng)于載藥丸芯（0.5h)， (：_為52.62ng/ml遠(yuǎn)低于載藥丸芯（332.00ng/ml),表明瓜爾膠-乙基纖維素 包衣小丸可在體內(nèi)延遲藥物釋放。

與本文第一章中的Eudragit FS30D包衣小丸和Eudragit FS30D/瓜爾股雙 層包衣小丸一樣，瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸在犬體內(nèi)只測(cè)得一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 血藥濃度，因此在圖3.14中僅對(duì)載藥丸芯做藥-時(shí)曲線圖，而對(duì)瓜爾膠-乙基 纖維素包衣小丸則以不同時(shí)間下實(shí)際檢出的平均血藥濃度柱狀圖表示藥物進(jìn) 入體循環(huán)的時(shí)間及濃度。從圖3.14可以看出：與速釋栽藥丸芯相比，瓜爾膠 -乙基纖維素包衣小丸可顯著延緩藥物釋放，口服包衣小丸5-7h后，藥物進(jìn) 入體循環(huán)，與體外5h左右的釋藥時(shí)滯接近，說(shuō)明混合衣層可以保護(hù)藥物安全 通過(guò)胃及小腸，到達(dá)結(jié)腸后才開始釋放藥物，因此瓜爾膠-乙基纖維素包衣小 丸顯示出較好的結(jié)腸靶向性。 

111/211〕s-q Jo 120^5S3!IS

-HI?—uncoated pellets O GG-EC coated

 

Fig.3.14 Mean plasma concentration-time profiles of 5-fluorouracil (dose 50 mg) following oral administration of uncoated pellets and GG-EC mixed coated pellets(GG: EC=1:2, CWG405%) in beagle dogs (n=5).Bars represent standard deviation,

4.小結(jié)

本章采取時(shí)間控制-酶促發(fā)雙重策略，將瓜爾肢和乙基纖維素混合后對(duì)載 藥丸芯進(jìn)行包衣，通過(guò)調(diào)節(jié)二者的比例及包衣增重即可實(shí)現(xiàn)延遲藥物釋放5h。 體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)瓜爾肢和乙基纖維素的比例為1:2,包衣增重為405% 時(shí)，藥物在5h左右的時(shí)滯后開始釋放，并在酶促作用下更快地將5-FU釋出， 藥物濃集于結(jié)腸局部，顯示出較好的結(jié)腸靶向性。

瓜爾膠和乙基纖維素混合后在流化床內(nèi)對(duì)小丸包衣，操作簡(jiǎn)便，釋藥時(shí) 滯可靠。兩種性質(zhì)的高分子材料配比使用，利用混合材料的親水性/疏水性實(shí) 現(xiàn)目標(biāo)釋藥時(shí)滯，改變了傳統(tǒng)時(shí)間控制型給藥系統(tǒng)采用的凝狡膨張/滲透泵/ 腸溶包衣等多種原理相結(jié)合的較為復(fù)雜的制備工藝[841]。這種新的延遲釋藥技 術(shù)不僅為OCDDS提供了簡(jiǎn)便可行的制備方法，同時(shí)也為脈沖給藥系統(tǒng)提供 了有效可行的新方法。